在生物制药技术领域,由于大肠杆菌(E.coli)表达的重组蛋白药物通常在细胞内形成没有生物活性的包涵体。利用盐酸胍或尿素等变性剂将包涵体溶解后通过蛋白复性才能获得具有生物活性的目标蛋白。通常采用稀释法和透析法进行蛋白复性时,变性蛋白易聚集沉淀导致其复性效率低,一般仅为5%～20%,而且难以与杂蛋白分离,这就直接影响了这类治疗蛋白质成本的降低。因此,重组蛋白药物的复性已成为制约生物工程产业化的技术瓶颈,研究如何提高重组蛋白药物的复性效率,发展适于大规模生产的高效复性方法对于生物工程的发展具有重大意义。近年来,液相色谱法已被广泛的应用于重组蛋白药物的复性与纯化中,可获得较高的复性效率和质量回收率,称之为蛋白折叠液相色谱法。最近,我们实验室合成出了一种同时具有疏水和离子交换基团的新型双功能色谱固定相,在一根双功能色谱柱上实现了在IEC和HIC两种模式下对蛋白质进行高效分离,其分离效果可以和相应的单模式商品柱的分离效果相媲美。一根双功能色谱柱可代替两根常用的离子交换和疏水色谱柱,实现了“一柱二用”的功能,被形象地称之为“2D色谱柱”。在此基础上开发出了单柱二维液相色谱新技术。与常规的二维色谱不同的是,在一根色谱柱上就可以完成HIC-IEC或IEC-HIC二维色谱。本论文利用所合成的双功能色谱柱,采用单柱二维液相色谱技术对重组蛋白药物重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)和重组人肿瘤因子-α(rhTNF-α)进行复性并同时纯化研究。全文主要包括以下四个部分:1.绪论系统的评述了目前变性蛋白在体外复性纯化的一些新技术。同时概述了液相色谱法对蛋白质复性的优势,并对混合模式色谱、单柱二维液相色谱在分离纯化蛋白中的应用进行了综述和展望,共引文献75篇。2.双功能色谱固定相对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的复性与同时纯化采用WAX/HIC双功能色谱分离介质,在离子交换和疏水两种模式下对rhG-CSF进行了复性与同时纯化的研究。分别考察了流动相中脲浓度、pH、GSH/GSSG比例、硫酸铵浓度和进样量对rhG-CSF复性与纯化的影响,结果表明采用一根双功能色谱柱在IEC和HIC两种模式下均可对rhG-CSF进行复性并同时纯化。在IEC模式下对rhG-CSF复性纯化,其质量回收率和纯度分别是39.93%和96.23%;在HIC模式下,其质量回收率和纯度分别是39.74%和96.03%。3.双功能色谱固定相在IEC模式下对重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-α)的复性与同时纯化采用WAX/HIC双功能色谱柱在离子交换模式下对重组蛋白药物rhTNF-α进行了复性与纯化研究。详细讨论了流动相中添加的脲浓度、GSH/GSSG比例、pH以及蛋白进样量等对rhTNF-α复性与纯化的影响。经优化后在离子交换模式最佳的复性条件下,rhTNF-α的质量回收率和纯度分别可达63.25%和96.72%。结果表明采用WAX/HIC双功能色谱柱在离子交换模式下可以实现对rhTNF-α的复性与纯化。4.双功能色谱固定相在HIC模式下对重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-α)的复性与同时纯化利用WAX/HIC双功能色谱介质在疏水模式下对rhTNF-α进行分离纯化。由于rhTNF-α的疏水性很强,在HIC模式下其与固定相之间的作用力非常强而难以洗脱,因此我们考察了流动相中添加的脲浓度对rhTNF-α洗脱的影响。结果表明只有流动相中添加8.0mol/L脲才能将rhTNF-α从固定相上洗脱下来。此外还讨论了进样量对rhTNF-α纯化的影响。在HIC模式的最佳条件下对rhTNF-α进行纯化,其纯度和质量回收率分别为 90.45%和 70.27%。利用该WAX/HIC双功能色谱柱构建了离线单柱二维液相色谱,首先第一维采用HIC模式对rhTNF-α包涵体提取液进行分离纯化,收集目标蛋白色谱馏分;第二维采用离子交换模式对第一维收集的目标蛋白色谱馏分进行复性并同时纯化,其纯度可高达98.32%,质量回收率为46.78%。进一步表明采用单柱二维液相色谱可在HIC和IEC两种分离模式下对重组蛋白药物进行分离纯化和复性,可将单柱二维液相色谱新技术发展成为单柱二维蛋白折叠液相色谱法。该技术一根色谱柱顶两根色谱柱用,可大大简化生产工艺,降低成本,对我国生物技术的发展具有重要的应用价值。