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目的:胃癌是我国最常见的胃肠道肿瘤之一;在全球范围内,其发病率居恶性肿瘤发病率第四位。H.pylori为胃癌重要的,独立的致病因素。以往研究中发现H.pylori感染可促进胃癌侵袭转移,但其机制尚不明确。此实验将对其分子机制进一步探索。健脾解毒方(JP)是上海市名老中医范忠泽教授的验方,通过前期临床研究发现JP具有很好的抗肿瘤作用,尤其JP对H.pylori阳性胃癌有较好的抗肿瘤增殖与侵袭转移以及促进胃癌患者正气恢复等治疗作用。本研究在前期研究的基础上,进一步探索JP抗H.pylori诱导的胃癌血管新生的分子机制,为JP的临床应用提供实验依据。 方法:本试验应用人胃腺癌细胞株MKN45细胞,通过用H.pylori处理MKN45细胞构建体外试验体系。 第一部分,根据H.pylori感染后的时间进行自然分组,在应用H.pylori处理MKN45细胞后0min,30min,lh,2h,6h,12h时抽提总蛋白以及RNA,同时收集细胞培养基。ELISA与荧光定量PCR技术检测细胞VEGF表达以及用western blot技术检测H.pylori处理MKN45细胞后PTEN/P-PTEN与AKT/P-AKT蛋白的表达水平随时间的变化情况。 第二部分,(1)应用siRNA-PTEN干扰质粒处理H.pylori感染的MKN45细胞,分组为空白对照组,H.pylori感染组, H.pylori感染+siRNA-PTEN干扰组,H.pylori感染+siRNA空质粒干扰组。(2)应用LY294002作用H.pylori处理的MKN45细胞,分组为空白对照组,H.pylori感染组, H.pylori感染+LY294002组。western blot检测处理后细胞PTEN/P-PTEN与AKT/P-AKT蛋白表达并用ELISA检测MKN45细胞培养基中的VEGF蛋白。 第三部分,用JP作用于H.pylori处理后MKN45细胞,分组为空白对照组,H.pylori感染组,H.pylori感染+JP低剂量组,H.pylori感染+JP中剂量组,H.pylori感染+JP高剂量组。ELISA检测细胞培养基中VEGF蛋白,同时应用血管成形试验检测VEGF诱导血管内皮细胞的体外成管能力;western blot检测处理后细胞PTEN/P-PTEN与AKT/P-AKT蛋白的表达。 结果: 第一部分:H.pylori处理MKN45细胞后0min,30min,1h,2h,6h,12h时PTEN与AKT总蛋白的表达水平并不随时间改变,其各时间点间蛋白表达水平比较,无差异;P-PTEN/P-AKT蛋白表达随时间变化而变化:其中P-PTEN蛋白的表达在2h呈现峰值,与其他时间点比较,差异均明显,且在2h之前,P-PTEN蛋白表达水平随时间延长而上调;在2h之后,P-PTEN蛋白表达下调;P-AKT蛋白的表达在6h前,随时间的增延长而增加;此后,随时间的增延长而下降;VEGF的表达也呈现出时间依赖性,表现出同P-AKT蛋白的表达一致的趋势,并且各时间点间蛋白表达差异均较明显。 第二部分:(1)用siRNA-PTEN干扰处理后,AKT蛋白表达未发生改变;PTEN/P-PTEN与P-AKT蛋白的表达均发生明显改变:其中PTEN/P-PTEN与P-AKT蛋白的表达水平在siRNA-PTEN干扰处理后,与H.pylori感染组以及空质粒干扰组比较均显著下降;在siRNA-PTEN干扰处理后,VEGF的表达与H.pylori感染组以及空质粒干扰组比较也呈现明显下降;(2)在用LY294002处理后,AKT蛋白的表达未见改变;P-AKT蛋白表达发生变化:LY294002处理后,P-AKT蛋白的表达比H.pylori感染组明显下调;且VEGF的表达呈现出于P-AKT蛋白的表达相同的趋势;第三部分,JP高、中、低剂量处理后,PTEN与AKT蛋白表达未发生明显改变,其各剂量组与H.pylori感染组以及空白组比蛋白表达均无差异;P-PTEN/P-AKT表达水平随JP的剂量改变而变化:其中P-PTEN/P-AKT蛋白表达在加JP处理后,与H.pylori感染组相比,P-PTEN/P-AKT蛋白表达均明显下调,且P-PTEN/P-AKT蛋白的表达水平随JP剂量的增加而下降,且各剂量组之间比较,蛋白表达水平差异也明显;在加JP处理后,VEGF蛋白含量以及HUVEC体外成管率随JP剂量的增加表达下降,且各剂量组间比较差异明显。 结论:H.pylori诱导胃癌血管新生机制可能是H.pylori激活PTEN/PI3K/AKT通路以促进VEGF表达;JP可能通过抑制PTEN/PI3K/AKT信号通路与VEGF的表达,从而抑制H.pyroli诱导的胃癌新生血管的形成,发挥抗癌作用。