论文部分内容阅读
第一部分新型高尔基蛋白在前列腺癌细胞和组织中的表达及意义[目的]探讨新型高尔基蛋白GOLPH3/GOLPH2在前列腺癌细胞系和前列腺癌组织中的表达特点及临床病理意义。[方法](1)采用定量PCR和Western blot方法检测前列腺癌细胞系PC-3、DU145、 LNCaP和22RV1中GOLPH3/GOLPH2mRNA水平和蛋白水平的表达情况。(2)采用细胞免疫荧光技术观察前列腺癌细胞DU145中GOLPH3/GOLPH2的定位情况。(3)运用免疫组化法检测前列腺组合组织芯片(其中前列腺癌50例,良性前列腺增生20例,正常前列腺组织10例)中GOLPH3/GOLPH2蛋白的表达情况,并分析GOLPH3/GOLPH2在不同前列腺组织中的表达差异。[结果](1)新型高尔基蛋白GOLPH3/GOLPH2在四株前列腺癌细胞PC-3、DU145、LNCaP和22RV1中均有表达,而且其表达在激素非依赖型细胞(PC-3、DU145)显著高于激素依赖型细胞(LNCaP和22RV1)。(2)GOLPH3/GOLPH2分别定位于前列腺癌细胞DU145高尔基体反面和顺面网络结构。(3)GOLPH3/GOLPH2在前列腺癌、良性前列腺增生、正常前列腺组织不同程度表达,其中GOLPH3阳性表达率分别为64%(32/50),30%(6/20)和20%(2/10),GOLPH2阳性表达率分别为92%(46/50),50%(10/20)和40%(4/10),差异具有统计学意义(P<0.05)。然而GOLPH3/GOLPH2高表达状态与前列腺癌病理分期和Gleason分级无明显相关性(P>0.05)。[结论](1)新型高尔基蛋白GOLPH3/GOLPH2在前列腺癌细胞和组织中过量表达。(2) GOLPH3/GOLPH2在前列腺癌细胞中的异常表达可能与激素敏感性有关。(3) GOLPH3/GOLPH2在前列腺癌组织中的异常表达可能是前列腺癌的一个重要特征,分析新型高尔基蛋白表达特点对前列腺癌的诊断具有重要意义。第二部分RNA干扰沉默GOLPH3对前列腺癌细胞PC-3生物学行为的影响[目的]通过观察RNA干扰沉默GOLPH3对前列腺癌细胞PC-3增殖力、侵袭力和迁移能力的影响,探讨GOLPH3在前列腺癌发生和转移中的作用。[方法](1)设计并合成7对shRNA引物,用限制性内切酶EcoRI和BamHI将pUEGH载体酶切,将线性化的pUEGH和shRNA进行连接转化,对其产物酶切鉴定；慢病毒表达质粒与包装辅助质粒共转染293T细胞包装成慢病毒载体pUEGH-GOLPH3shRNAo (2) qPCR和Western blot方法检测慢病毒感染后细胞株中GOLPH3的mRNA和蛋白水平的表达变化,评价RNAi干扰的效果。(3)采用MTT实验方法检测感染GOLPH3RNAi后PC-3细胞增殖生长情况的变化；使用Transwell实验方法检钡GOLPH3shRNA转导PC-3后细胞侵袭能力和迁移能力的改变。[结果](1)PCR及酶切证实pUEGH-GOLPH3shRNA慢病毒构建成功。(2)GOLPH3shRNA慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体感染细胞后,qPCR和Westernblot方法分析后发现与感染阴性病毒载体组相比,感染GOLPH3shRNA的PC-3细胞内GOLPH3mRNA水平和蛋白水平分别下降79.40%和75.35%(P<0.05),GOLPH3shRNA对GOLPH3在mRNA水平和蛋白水平的抑制率均很理想。(3)细胞增殖实验结果显示与阴性对照慢病毒载体组相比,GOLPH3shRNA慢病毒载体组对PC-3细胞增殖没有显著影响(P>0.05)。Invasion和Migration实验结果显示感染GOLPH3shRNA后的PC-3细胞穿过滤膜的细胞数较阴性对照组明显减少(P<0.05)。GOLPH3基因沉默后PC-3细胞侵袭和迁移能力明显减弱。[结论](1)成功构建GOLPH3基因沉默的前列腺癌细胞稳定株。(2)利用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默GOLPH3基因,可以有效降低前列腺癌细胞PC-3中GOLPH3的表达。(3)GOLPH3基因沉默后,前列腺癌细胞的增殖和生长没有明显改变,但是前列腺癌细胞侵袭和迁移能力明显降低。这说明GOLPH3在前列腺癌转移的过程中发挥重要作用,利用RNAi技术下调GOLPH3的表达有望成为一种有效治疗前列腺癌的新方法。第三部分GOLPH3RNAi抑制前列腺癌细胞PC-3侵袭和迁移的相关分子机制探讨[目的]探讨shRNA介导的GOLPH3沉默抑制前列腺癌细胞PC-3侵袭和迁移的相关分子机制。[方法](1)采用qPCR方法在mRNA水平检测肿瘤转移相关基因及因子IGF1、Furin、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10、MMP14、TTMP2、VIM、 MSN、E-Cadherin、CD44、MYH9、VEGF-A、ACTR2在GOLPH3RNAi及其阴性对照组细胞中的表达情况。(2)采用Western blot在蛋白水平进一步验证上述有变化的肿瘤转移相关基因及因子在GOLPH3RNAi及其阴性对照组细胞中的表达情况。[结果](1)qPCR结果显示干扰GOLPH3基因后,PC-3细胞内IGF1、MMP2、 MMP9、MSN、VIM、E-Cadherin、TIMP2的mRNA表达量下降,其中IGF1、MMP2、 MMP9、VIM表达量下降显著(P<0.05)。而Furin、MMP1、MMP3、MMP10、MMP14、 CD44、MYH9、VEGF-A、ACTR2的mRNA表达量上升。(2)Western blot结果进一步显示干扰GOLPH3基因后,PC-3细胞内MMP9蛋白表达显著降低,其它蛋白表达量变化不明显。[结论](1)在转录水平GOLPH3可能通过增强IGF1、MMP2、MMP9、VIM的表达促进前列腺癌细胞的侵袭和迁移。(2)在蛋白水平GOLPH3通过增强MMP9的表达促进前列腺癌细胞的侵袭和迁移。(3)GOLPH3调控转移相关基因转录水平和蛋白水平表达没有出现一致性的调节,这提示GOLPH3在前列腺癌细胞调节作用可能存在某种负反馈机制。第四部分GOLPH3对表皮生长因子受体(EGFR)信号通路调控的研究[目的]探讨shRNA介导的GOLPH3沉默与EGFR信号通路的调控关系。[方法]我们采用Western blot方法检测EGFR信号通路中关键蛋白EGFR、p-EGFR、Src、p-Src、FAK、p-FAK、Akt、pAkt、mTOP、p-mTOR、p70S6K、 p-p70S6K在GOLPH3RNAi及其阴性对照组细胞中的表达变化情况。[结果]Western blot结果显示,干扰GOLPH3基因后前列腺癌细胞PC-3内的p-EGFR、p-Src蛋白表达量显著降低,而EGFR、Akt、pAkt、mTOR、p-mTOR、 Src、FAK、p-FAK、p70S6K、p-p70S6K蛋白表达量无明显变化。阻断GOLPH3能抑制EGFR-Src信号通路的活化,而阻断GOLPH3对Akt-mTOR-p70S6K信号通路及FAK信号通路影响作用不大。[结论]GOLPH3能调控EGFR蛋白磷酸化及其下游Src蛋白磷酸化的表达,但不能调控EGFR下游的Ak、mTOR、FAK、p70S6K蛋白及其磷酸化的表达。GOLPH3可能通过调控EGFR-Src信号通路及其底物MMP9影响前列腺癌的侵袭和转移。