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第一部分：HMGB1通过JAK/STAT3通路调节宫颈癌细胞干性的研究目的：研究高迁移率族蛋白B1 (High-mobility group box-1, HMGB1)是否通过JAK/STAT3 (Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)信号通路调节宫颈癌的干性方法：1.利用DNA重组技术分别构建HMGB1、STAT3过表达质粒,经测序、酶切鉴定正确后,利用脂质体转染宫颈癌细胞中,通过qRT-PCR、Western blot检测其过表达效率；同时设计、合成针对HMGB1特异性siRNA,利用脂质体转染宫颈癌细胞中,通过qRT-PCR、Western blot检测其干扰效率,选择干扰效率最高的siRNA进行后续实验.2.采用Western blot方法分别检测HMGB1上调(或抑制)表达后对pJAK/JAK, pSTAT3/STAT3和干细胞标记物(OCT4、Sox2和Nanog)表达的影响；通过免疫荧光观察HMGB1上调(或抑制)后JAK和STAT3细胞定位的变化,并分别通过流式细胞技术和肿瘤球形成实验检测干细胞标记物(OCT、Sox2和Nanog)比例和肿瘤球形成情况。3.采用Western blot方法分别检测STAT3上调(或者抑制)后对干细胞标记物(Nanog)表达的影响；并分别通过流式细胞技术和肿瘤球形成实验检测干预STAT3后干细胞标记物(OCT4、Sox2和Nanog)比例和肿瘤球形成情况。结果：1.HMGB1 CDS通过化学合成的方式获得,通过基因重组方式重组入GV230真核过表达质粒中;STAT3 CDS区域通过PCR方式调取,通过基因重组方式重组入GV316载体中。通过酶切、菌液PCR、Western blot及qRT-PCR等方式验证载体构建成功,满足后续实验要求。同时通过Western blot及qRT-PCR检测HMGB13条特异性的siRNA片段的干扰效率,其中HMGB1-3的干扰效率达到80%以上,满足后续实验要求。2.与空载体组和HMGB1低表达组相比,HMGB1过表达组中pJAK、JAK、 pSTAT3、STAT3、干细胞标记物(OCT、Sox2和Nanog)蛋白表达量明显增高,差异具有统计学意义(P<0.01)；与空载体组和HMGB1低表达组相比,HMGB1过表达组中pSTAT3和pJAK明显增多,且主要集中于细胞核内,干细胞标志物的比例和微球形成率也明显增高(P<0.05)。3.与空载体组和STAT3低表达组相比,STAT3过表达组中Nanog蛋白表达量明显增高,差异具有统计学意义(P<0.01)；与空载体组和STAT3低表达组相比,STAT3过表达组中干细胞标志物的比例和微球形成率也明显增高(P<0.05)。结论：HMGB1可以通过JAK/STAT3来诱导宫颈癌的干细胞样特性,JAK/STAT3在这一级联反应中可以作为HMGB1和Nanog之间的一个桥梁。第二部分：HMGB1/STAT3/Nanog信号通路在宫颈癌顺铂化疗耐药中的作用目的：研究HMGB1/STAT3/Nanog信号通路是否介导了宫颈癌顺铂化疗敏感性的调控。方法：体外培养宫颈癌耐药细胞株(Siha/DDP),下调MGB1和过表达STAT3后分别利用克隆形成法检测细胞增殖水平和Westernblot检测细胞DNA损伤相关蛋pH2AX, p53BP1,通路相关蛋白pSTAT3和干细胞相关标志物Nanog蛋白表达的变化；并通过AnnexinV/P1双染法检测细胞凋亡、PI单染法检测细胞周期和流式细胞技术检测干细胞标记物(OCT4、Sox2和Nanog)的表达。结果：1. SiHa/DDP细胞顺铂耐药指数为8.58,提示SiHa/DDP细胞显著耐药。2.与空载体组相比,HMGB1低表达组和HMGB1低表达+过表达STAT3组中集落形成计数明显减低(p<0.05)；p53BP1、pH2AX升高(p<0.05)和pSTAT3和Nanog蛋白明显降低(分别为p<0.05和p<0.001);细胞凋亡率增加和G1期分布增高p<0.05),干细胞标记物(OCT4、Sox2和Nanog)表达降低(p<0.005)。实验说明HMGB1低表达可致细胞生长缓慢、DNA损伤修复抑制、肿瘤细胞增殖变慢和干细胞标记物(OCT4、Sox2和Nanog)比例减少。结论：HMGB1/STAT3/Nanog信号通路在顺铂对宫颈癌的化疗敏感性中起到重要的调控作用,下调HMGB1表达有助于增强顺铂对宫颈癌化疗的敏感性。第三部分：HMGB1/STAT3/Nanog相关性的临床研究目的：研究高迁移率族蛋白B1、信号转导因子3与宫颈癌干细胞标志物Nanog的相关性及其对宫颈癌预后的影响。方法：采用免疫组织化学方法检测HMGB1、STAT3和Nanog在78例宫颈癌中的表达,应用t检验、卡方检验、Spearman等级相关分析、Cox回归统计分析其表达水平、相关性及与预后的关系。结果：1. HMGB1、STAT3和Nanog在宫颈癌组织中均高表达,HMGB1及STAT3表达增高,Nanog增高;HMGB1及STAT3表达降低,Nanog降低。HMGB1的表达与STAT3和Nanog之间均正相关。2. HMGB1、STAT3和Nanog高表达者的生存时间显著低于HMGB1、STAT3和Nanog低表达组。3.多因素分析发现：HMGB1、分化程度、淋巴结状态、宫颈浸润深度、阴道切缘是影响5年生存的独立预后因素。结论：HMGB1、STAT3和Nanog在宫颈鳞癌组织中高表达,其可促进宫颈癌进展,进而影响宫颈癌预后。