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奶牛乳房炎是奶牛的一种多发病、常见病，导致了奶牛场的巨大经济损失。链球菌(停乳链球菌，乳房链球菌和无乳链球菌)是奶牛乳房炎主要致病菌种之一。用疫苗来防治奶牛乳房炎具有良好的应用前景，目前链球菌疫苗的研究集中于灭活疫苗和亚单位疫苗，并且效果都不理想。DNA疫苗所表达的外源抗原具有与天然抗原相同的构象和免疫原性，可以同时激发机体产生细胞免疫和体液免疫。
本课题目的：利用分子佐剂牛C3d改造真核表达载体，同时选择多种保守性的关键抗原靶位基因，构建免疫增强型重组链球菌DNA疫苗，经免疫接种小鼠动物模型，考察疫苗的体液免疫，细胞免疫效果，探讨其作为链球菌奶牛乳房炎防治疫苗的可行性。
首先以牛肝总RNA为模板，通过RT-PCR获得牛C3d基因，运用pSec Tag2质粒克隆和实现分子C3d的偶联，成功构建了重组质粒pSec Tag2-C3d3，然后将C3d3克隆到pcDNA3.1中，并引入Kozak促真核翻译序列，成功构建了免疫增强DNA疫苗载体pcDNA3.1-C3d3。然后以停乳链球菌基因组为模板PCR扩增获得广泛存在于链球菌表面的脱氢酶GapC基因和停乳链球菌纤粘连蛋白结合因子FnBB的功能单位B3片段，并以此为抗原基因克隆到载体pcDNA3.1和pcDNA3.1-C3d3中分别构建四种DNA疫苗pcDNA3.1-GapC,pcDNA3.1-B3，pcDNA3.1-GapC-C3d3和pcDNA3.1-B3-C3d3。
对DNA 疫苗的初步免疫效果检测发现，pcDNA3.1-GapC,pcDNA3.1-GapC-C3d3，pcDNA3.1-B3，pcDNA3.1-B3-C3d3可以诱导小鼠产生体液免疫反应，抗体最高效价分别为1:400，1:3200，1:100，1:100。pcDNA3.1-B3、pcDNA3.1-GapC和pcDNA3.1-GapC-C3d3可以引发细胞免疫反应，刺激指数分别为1.590±0.031，1.406±0.366，1.332±0.132。pcDNA3.1-GapC-C3d3抗体最高效价为pcDNA3.1-GapC的4倍，证实牛C3d3可以显著增强抗原在小鼠体内的体液免疫应答。
在获得GapC基因和B3片段基础上，成功构建了重组原核表达载体pET32-GapC和pET32-B3。重组蛋白抗原Trx-GaoC和Trx-B3通过大肠杆菌表达系统获得了高表达，其蛋白含量分别达到全菌蛋白的80％和90％以上。通过Ni<2+>螯合亲和色谱建立了高效的纯化方法，Trx-GapC和Trx-B3纯度分别达到95％和99％。重组蛋白抗原Trx-GapC和Trx-B3免疫小鼠后最高效价均可以达到1:1000000，证实本实验所构建的重组蛋白抗原能够在机体引起强烈的体液免疫反应。
奶牛免疫实验正在进行中，两次免疫后得到了初步的体液免疫结果：免疫DNA疫苗pcDNA3.1-GapC-C3d3和重组蛋白疫苗Trx-GapC后第六周，血清中平均效价分别可以达到1:50和1:200，提示本实验研制的DNA疫苗和蛋白疫苗可用于预防奶牛乳房炎。