小胶质细胞是19世纪发现的继神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞之后的中枢神经系统第四类细胞。小胶质细胞在脑内广泛分布,约占胶质细胞总量的5%-20%。目前对于小胶质细胞的来源仍存在争议,广为接受的学说认为其起源于卵黄囊的血岛及血液中的单核细胞。作为中枢神经系统内最重要的免疫细胞,小胶质细胞不仅参与神经发生的生理过程,而且在神经退行性病变、神经损伤以及肿瘤等多种病理过程中发挥着重要的作用。在成熟神经系统中,静息状态的小胶质细胞为分支状,胞体小,具有伸向各个方向的细胞突起,用以检测周围环境的变化。静息状态的小胶质细胞具有吞饮功能和一定的迁移能力,可清除代谢产物及神经元正常重塑过程中产生的细胞碎片,还可分泌生长因子促进神经元的存活。当外源性物质入侵,发生神经系统疾病或损伤时,小胶质细胞立即激活,并发生明显的形态改变：其分支状突起变粗变短,形成灌木样,进而胞体变圆、突起消失,成为“阿米巴样”。阿米巴样小胶质细胞具有较强的吞噬能力,其功能类似于单核巨噬细胞,在中枢神经系统内发挥重要的免疫效应。脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS),三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP),p淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein, β-APP),低氧,促炎性因子等均可诱发小胶质细胞的激活,引发瀑布式炎症反应,导致神经损伤的发生与进展。激活的小胶质细胞免疫表型与功能发生明显变化。首先,激活的小胶质细胞MHCII类抗原表达明显增加,分泌大量的炎性因子,如白介素-1 (interleukin-1, IL-1)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)、转化生长因子-p(transforming growth factor-β, TGF-p)、前列腺素(prostaglandin, PG)、反应氧簇(reactive oxygen species, ROS)、一氧化氮(nitric oxide, NO)和兴奋性氨基酸等。这些免疫效应分子可以通过不同的途径作用于神经元或少突胶质细胞等,直接导致靶细胞的凋亡。炎性因子还可以作用于星形胶质细胞,促进星形胶质细胞炎性因子的释放,并反馈性的加剧小胶质细胞自身炎性反应的发生。其次,激活的小胶质细胞还可以分泌与迁移相关的趋化因子,并且上调表达趋化因子受体,从而介导小胶质细胞向损伤部位迁移,加重损伤区域炎症反应的进行。与此同时,激活的小胶质细胞加速增殖,进一步促进损伤区域炎症反应的发生。总之,激活的小胶质细胞可以通过以上行为的改变,介导炎症反应的发生,从而导致神经损伤及疾病的发生与进展。因此,抑制小胶质细胞的激活、减轻炎症反应,已成为防治神经系统疾病的一个重要策略。只有阐明小胶质细胞的激活机制,才能实现针对性的抑制其活化。目前关于小胶质细胞的激活机制研究中,已经发现核转录因子kappa B (NF-κB),丝裂原蛋白激酶通路(MAPKs)等多个信号通路均有参与,但是其具体的机制仍不清楚。因此阐明小胶质细胞激活机制,是实现抗炎治疗的前提与研究重点。Notch信号通路在进化上高度保守,结构简单,是调控胚胎发育的重要信号通路。哺乳动物表达四个Notch受体(Notchl-4)和五个配体(Jagged1、2和Delta-like-1、3、4). Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用,Notch蛋白经过三次剪切,释放胞内段(intracellular Notch receptor domain, NICD)入胞质,NICD进而转位进入细胞核,并与核内转录因子RBP-Jκ结合,形成NICD/RBP-Jκ转录复合体,调控下游靶基因的转录表达,发挥生物学效应。Notch信号通路可以调控多种器官的发生。在神经系统的发育过程中,Notch信号通路对神经干细胞的增殖分化,成熟神经元及少突胶质细胞的功能等都具有重要的调节作用。在免疫系统中,Notch信号通路参与T细胞、B细胞以及单核巨噬细胞等多种免疫细胞的功能调控。值得注意的是,Notch信号通路可以调控单核巨噬细胞的极化,其过度活化可以导致M1型巨噬细胞的数量增多,从而引起促炎性因子的大量释放。如前所述,最广泛的研究认为小胶质细胞来源于卵黄囊的血岛及血液中的单核细胞,其功能类似于的单核巨噬细胞,并且目前研究提示Notch信号通路可能参与神经炎症的发生,因此,我们推测Notch信号通路参与调控小胶质细胞的功能。缺氧性损伤是多种神经疾病及神经损伤的共同病理特征。发育中的大脑对低氧尤为敏感,多种原因可能导致胎儿及新生儿的大脑发生缺氧性损伤。若缺氧发生在早产儿,易导致脑室周围白质病变(Periventricular damage, PWMD),严重者可发生脑室周围白质软化(Periventricular Leukomalacia, PLV),从而导致胎儿及新生儿死亡或神经发育异常。其中,小胶质细胞介导的炎症反应在这一病理改变中发挥重要作用。本课题利用新生大鼠低氧性脑损伤的动物模型,及小胶质细胞激活的体外模型,探讨Notch信号通路在小胶质细胞激活过程中的作用,并分析其作用机制。首先,检测新生大鼠低氧性脑损伤后Notch信号通路在脑内的表达,明确其是否在小胶质细胞中表达及损伤后表达量的变化,并利用原代培养的小胶质细胞及BV-2细胞系明确Notch信号通路的表达、激活及对炎症相关因子等释放的影响。其次,利用经典的脂多糖刺激诱导小胶质细胞活化,观察Notch信号通路对小胶质细胞增殖以及迁移的影响及其机制。最后,我们对Notch信号通路调控小胶质细胞活化的机制进行研究。具体的研究内容及结果如下：第一部分,低氧环境下Notch信号通路在新生大鼠小胶质细胞中的表达及作用。免疫荧光结果显示,在低氧性脑损伤的新生大鼠中,胼胝体区小胶质细胞中Notch信号通路的受体Notch-1,配体Delta-1以及Notch-1蛋白活化后形成的活性片段NICD表达增强。其次,在原代培养的小胶质细胞中,利用qPCR及免疫荧光针对Notch-1、Delta-1、NICD,以及NICD在细胞核内结合的分子RBP-Jκ、下游基因Hes-1的表达进行检测,结果证实原代培养的小胶质细胞经低氧处理后,Notch-1、Delta-1、NICD、RBP-Jκ及Hes-1的表达均增高,说明低氧处理后的小胶质细胞中Notch信号通路的表达和激活显著增强。应用γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路,经qPCR检测发现阻断Notch信号通路后多种炎症相关因子的mRNA水平显著降低。再次,在低氧处理的BV-2细胞系中检测Notch信号通路的表达及功能。利用qPCR和Western blot对上述Notch信号通路中的分子进行检测。结果表明,活化的小胶质细胞中Notch-1、Delta-1表达明显增高,NICD、RBP-Jκ、及下游基因Hes-1表达均增多。应用γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路,Western blot结果显示小胶质细胞内炎性因子的释放显著降低,且Griess去检测证实一氧化氮(nitric oxide, NO)释放量明显降低。NF-κB信号通路是小胶质细胞中介导炎性因子释放的最主要的信号通路,我们进一步发现Notch信号通路阻断后可以抑制BV-2细胞以及低氧损伤大鼠小胶质细胞中NF-κB信号通路的激活。这些结果表明,低氧诱导的小胶质细胞活化依赖Notch通路的作用,Notch通路参与低氧调控的小胶质细胞内多种炎症相关因子的产生。第二部分,Notch信号通路对小胶质细胞增殖及迁移的影响。我们利用经典的脂多糖刺激诱导小胶质细胞活化,观察Notch信号通路对小胶质细胞增殖以及迁移的影响。首先BrdU掺入实验及流式细胞术分析结果显示Notch信号通路阻断后小胶质细胞的增殖受到明显抑制,细胞周期发生阻滞。细胞周期蛋白Cyclin D1表达较激活BV-2细胞明显降低,而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitors, CDKI) p27kip1的mRNA及蛋白水平均显著增高。染色质免疫共沉淀结果显示Notch信号通路关键基因RBP-Jκ和Hes-1均可以结合在p27kipl的启动子区域,作为负转录因子直接调控p27kip1的表达。其次,transwell实验结果显示Notch信号通路阻断后小胶质细胞的迁移受到抑制。肌动蛋白F-actin探针检测发现F-actin;在活化小胶质细胞内的重分布受到影响。这些结果证实Notch言号通路可以调节小胶质细胞的增殖和迁移过程。第三部分,Notch信号通路调控小胶质细胞激活的分子机制。对Notch信号通路调控小胶质细胞活化的具体分子机制进行探讨。首先,Western blot结果显示,Notch信号通路阻断后NF-κB, MAPKs中的p38,INK (c-Jun N-terminal kinase)等多个通路的激活均受到显著抑制。其次,这些通路激活途径中的共同分子TAK1的活化明显降低。K63位特异性泛素化抗体进行western blot检测,显示TAK1位置处泛素化水平明显降低。再次,通过qPCR, Western blot以及免疫染色等发现,Notch信号通路阻断后,去泛素化酶头帕肿瘤综合征蛋白(Cylindromatosis, CYLD)的]mRNA及蛋白水平显著提高。最后利用染色质免疫共沉淀进行研究,发现Hes-1作为负转录因子直接结合在CYLD的启动子区域调控CYLD的表达。这些结果提示Notch信号通路可能通过调节去泛素化酶CYLD的表达影响小胶质细胞中NF-κB,p-38,JNK等多种关键通路的激活,从而调控小胶质细胞的活化结论：本课题通过在体动物实验发现新生大鼠低氧性脑损伤时,小胶质细胞中Notch信号通路的表达增强,并通过体外实验证实Notch信号通路可介导活化的小胶质细胞中炎症相关因子的释放,影响细胞增殖与迁移。因此,Notch信号通路可影响小胶质细胞的多种生物学特性。阻断Notch信号通路可抑制小胶质细胞介导的炎症反应,可能对其参与的神经系统疾病具有潜在的防治作用。