Lin28B、CyclinD1在TNF-α诱导的鼠Tenon’s囊成纤维细胞增殖中的作用机制的研究

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目的:本研究通过体外原代培养大鼠的 Tenon’s囊成纤维细胞(Tenon’s capsule fibroblasts,TCFs),利用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)刺激Tenon’s囊成纤维细胞的增殖,检测RNA结合蛋白Lin28B和细胞周期蛋白Cyclin D1的表达变化,以研究Lin28B及Cyclin D1在Tenon’s囊成纤维细胞增殖中的作用机制,并探究其在滤过泡瘢痕化过程的作用。  方法:贴壁法原代培养大鼠的TCFs,行HE染色、免疫组化法检测波形蛋白、角蛋白进行鉴定。取传至第四代的细胞消化至浓度为2×104/ml的悬液种入96孔板,分别加入终浓度为10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的TNF-α,采用CCK-8法分别于3h、6h、12h、24h及48h时检测成纤维细胞的生长状况,测出TNF-α的最佳干预浓度及时间。取传至第四代的细胞以浓度为2×104/ml的消化悬液种入12孔板,血清饥饿过夜,随机分为三组:A组加终浓度50ng/ml TNF-α的培养基,培养12h;B组为加入100μmol/L的PDTC刺激细胞0.5h后加入终浓度50ng/ml TNF-α的培养基,培养12h;C组为加入100μmol/L的PDTC刺激细胞0.5h后加入终浓度50ng/ml TNF-α的培养基,培养24h;检测各组细胞生长状况,行免疫组化及Real-time PCR法检测各组Lin28B及Cyclin D1的表达变化。  结果:1.组织块贴壁法培养的鼠眼Tenon’s囊成纤维细胞行HE染色结果示:细胞呈典型的长梭形,细胞核清晰可见呈蓝紫色,椭圆形,为单个或多个;胞质呈浅紫红色;免疫组化鉴定:角蛋白染色呈阴性表达,波形蛋白染色呈阳性表达。  2.三组成纤维细胞Lin28B mRNA的表达具有显著统计学差异(F=580.903,P=0.000)。B组、C组Lin28B mRNA的表达量均明显低于A组(P分别为0.000、0.000);B组表达少量Lin28B mRNA,但B组与C组相比,Lin28B mRNA的表达量仍偏高(P=0.003)。A组细胞的细胞质中Lin28B呈强阳性表达,平均光密度值B、C组明显少于A组;B组细胞胞质中Lin28B呈阳性表达,C组少量细胞胞质中Lin28B呈弱阳性表达,平均光密度值也明显低于B组。  3.三组成纤维细胞 Cyclin D1 mRNA的表达也具有显著统计学差异(F=558.667,P=0.000)。B组、C组Cyclin D1 mRNA的表达量均明显低于A组(P分别为0.000、0.000);且C组Cyclin D1 mRNA的表达量也明显低于B组(P=0.000)。A组细胞胞核中Cyclin D1呈强阳性表达,平均光密度值B、C组明显少于A组;B组细胞胞核中Cyclin D1呈阳性表达,C组少量细胞胞核中Cyclin D1呈弱阳性表达,平均光密度值也明显低于B组。  4.对Lin28B和Cyclin D1 mRNA的表达量进行相关性分析,结果显示r=0.953,P<0.001。Lin28B与Cyclin D1呈正相关性。  结论:  1.Lin28B、Cyclin D1的mRNA及蛋白在TNF-α诱导增殖的Tenon’s囊成纤维细胞中的表达量均明显增多,与Tenon’s囊成纤维细胞的增殖过程密切相关。  2.Lin28B mRNA与Cyclin D1 mRNA的表达量呈正相关性,提示Lin28B的激活可以直接或间接上调Cyclin D1的表达,加速细胞由G1期进入S期,缩短细胞周期进程,促进成Tenon’s囊纤维细胞增殖。  3.调控Lin28B-Cyclin D1通路抑制Tenon’s囊成纤维细胞增殖有可能成为抑制青光眼术后滤过泡瘢痕化的新靶点。
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