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目的：
根据肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在肿瘤发生进展过程中的促进作用和NK4对HGF的拮抗作用,构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,转染人高侵袭转移肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)细胞LM3,观察其转染效率及表达情况。研究NK4高表达后,HCCLM3细胞增殖、凋亡的改变,及对细胞侵袭能力的影响。
方法：
采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)从HGFcDNA中克隆NK4基因,并经测序鉴定。将NK4基因与带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(IRES)-EGFP融合,构建携带NK4/EGFP双基因的慢病毒表达载体并鉴定。利用293T细胞进行慢病毒的包装,将病毒原液浓缩,测定病毒滴度。以不同感染复数(MOI)的重组慢病毒感染293T细胞,筛选出最适MOI转染HCCLM3细胞,荧光显微镜下观察转染效率。Westernblot法测定细胞中NK4蛋白表达水平。MTT法测定转染NK4后HCCLM3细胞增殖能力变化。AnnexinV-PE/7-AAD双染后用流式细胞术分析转染NK4对HCCLM3细胞凋亡的影响。通过Transwell法检测转染后HCCLM3细胞侵袭能力的变化。
结果：
1、PCR获得目的基因片段,凝胶电泳观察到约1344bp的特异条带,经酶切鉴定及测序验证表明NK4基因已经成功克隆。NK4克隆质粒pMD-19T-NK4与载体plenti6.3-MSC-IRES-EGFP/V5R进行酶切、连接、转化后,对载体进行酶切鉴定,结果显示在9300bp附近有一特异性条带,与预期相符合,提示含NK4/EGFP双基因的慢病毒表达载体pLenti6.3-NK4-IRES2-EGFP构建成功,并经测序验证比对一致。
2、构建的Lenti6.3-NK4-IRES2-EGFP重组慢病毒表达载体转入293T细胞后48h,荧光倒置显微镜下可观察细胞有绿色荧光表达,转染效率高达90%以上。Lenti6.3-NK4-IRES2-EGFP病毒浓缩后,测得病毒的滴度为:1.05×108TU/ml。实验筛选出的最适MOI=7,转染HCCLM3细胞后,携带NK4基因的HCCLM3细胞NK4高表达。Westernblot检测发现,稳定转染NK4基因的HCCLM3细胞能够自分泌分子量约50KD的NK4蛋白。
3、MTT法测得HCCLM3/NK4转染组、HCCLM3/空载体组和HCCLM3对照组在各个时间点的细胞增殖情况显示,各时间点(除24h外),NK4转染组细胞生长明显减少,与空载体组、对照组相比有显著性差异(P＜0.05);空载组和对照组比较,差异无显著性(P＞0.05)。
4、流式细胞仪分检测NK4组、空载体组和对照组细胞凋亡,NK4转染组细胞凋亡明显增加,凋亡率为27.69±2.21%,与空载体组(7.24±0.18%)和对照组(6.51±0.23%)相比,差异有统计学意义(P＜0.05);空载体组细胞凋亡与对照组相比无明显差异。
5、当细胞培养基中有HGF存在时,对照组和空白载体组的侵袭力显著高于细胞培养基中无}tGF。(P＜0.05)存在时,说明HGF可以显著提高肝癌细胞的侵袭能力。当有HGF存在时,NK4组通过的数量明显少于对照组和空载体转染组(P＜0.05);但当培养基中无HGF存在是,NK4转染组、空载体组、对照组细胞通过数无明显差异(P＞0.05)。说明NK4可以显著抑制HGF诱导的HCCLM3细胞侵袭作用。
结论：
1、成功构建含有NK4基因的慢病毒表达载体pLenti6.3-NK4-IRES2-EGFP质粒。经测序鉴定及酶切鉴定结果与预期相符,为NK4基因的体外实验研究提供基础。
2、用最适MOI转染HCCLM3细胞后,筛选阳性克隆后进行指标检测,稳定转染NK4基因的HCCLM3细胞可以自分泌NK4蛋白。
3、体外实验证明NK4可以有效抑制HCCLM3的增殖,诱导细胞凋亡,并且降低了细胞的侵袭能力,为HCC的治疗及预防转移提供了新的途径。