研究背景神经病理性疼痛是神经系统原发性损伤或功能异常所导致的痛觉异常或痛觉过敏。创伤、缺血性损伤、感染或炎症、肿瘤、药物和压迫等原因均可以引起神经病理性疼痛。非甾体类抗炎药和阿片类镇痛药以及三环类抗抑郁药不仅治疗效果不理想，而且副作用很大。因此寻找一种安全有效、作用持久的镇痛方法已成为神经病理性疼痛研究的重要方向。神经病理性疼痛的受体机制研究表明，神经元和神经胶质细胞膜上的NMDA受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)表达上调或过度激活可引起中枢敏感化，在神经病理性痛的产生如自发性痛，触诱发痛及痛觉过敏中起重要作用。NMDA受体的2B亚基(NR2B)在体内呈选择性分布，主要位于脊髓背角、前脑等与痛觉传递有关的区域，提示NR2B可能是一个潜在的镇痛治疗靶点。据此，我们将NR2B基因插入腺病毒，成功构建了NR2B重组腺病毒镇痛疫苗(recombinantadenovirus serotype 5 mediated NR2B gene transfer，rAd5/NR2B)，并在神经病理性痛模型大鼠体内已经被证实能够表达NR2B抗原以诱导机体产生NR2B特异性抗体，并与神经元或胶质细胞膜上的NR2B结合，下调NR2B的表达或阻断NR2B的激活，在神经病理性疼痛模型中发挥良好的镇痛作用。然而，NMDA不仅参与了疼痛病理过程，而且广泛参与机体的多种生理活动，如学习记忆、突触可塑性等，并在其中起着重要的作用。因此利用NMDA受体拮抗剂治疗疼痛或多或少都会引起其他生理状态的改变。研究表明，氯胺酮在产生镇痛作用的同时对大鼠的空间学习与记忆能力产生了明显的损害，神经元也发生空泡样改变。同样，应用NMDA受体拮抗剂MK801后大鼠的空间学习和记忆功能下降，神经发育受到影响。基于此，我们拟研究rAd5/NR2B镇痛疫苗在治疗大鼠神经病理性疼痛同时，对部分生理功能的影响，以评价其安全性。本研究通过四个方面的观察，评价rAd5/NR2B镇痛疫苗应用于大鼠疼痛治疗的安全性。1．rAd5/NR2B镇痛疫苗对谷氨酸诱导的离体海马神经元凋亡的影响：利用rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫大鼠，提取免疫血清，并在体外培养大鼠原代海马神经元，加入免疫血清，观察神经元胞内钙及其凋亡的变化；2．rAd5/NR2B镇痛疫苗对大鼠体内神经元凋亡的影响：大鼠经rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫后，通过免疫组织化学染色和Western blot方法分别检测大鼠脊髓和海马组织中活化Caspase-3蛋白的表达以评价神经元的凋亡情况；3．rAd5/NR2B镇痛疫苗对大鼠认知功能的影响：利用rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫大鼠，Morris水迷宫实验观察大鼠空间学习与记忆功能的改变，并检测大鼠海马组织中NR2B蛋白的表达水平；4．rAd5/NR2B镇痛疫苗影响大鼠认知功能的电生理学和分子学机制：使用电生理学检测方法观察rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫大鼠海马组织长时程增强(Long-termpotentiation，LTP)的诱发和维持，并检测大鼠海马组织中磷酸化tau蛋白和NR2B蛋白表达水平的变化。研究方法与结果1．rAd5/NR2B镇痛疫苗对谷氨酸诱导的离体海马神经元凋亡的影响方法：选取雌性SD大鼠(n=6)，通过灌胃的方法给予rAd5/NR2B镇痛疫苗(1×10~8PFU)免疫大鼠，2周后以相同的剂量加强免疫一次。初次免疫后4周，断尾法取静脉血，制备免疫血清，并通过ELISA检测血清中NR2B特异性抗体的滴度，同时取正常大鼠静脉血制备正常大鼠血清。取24h内新生SD大鼠，分离海马组织，体外培养原代神经元。培养1周后利用Fluo-4/AM标记原代神经元胞内钙，在激光扫描共聚焦显微镜下观察免疫血清对原代神经元胞内钙浓度的影响。神经元培养1周后分为四组，对照组(Naive组)、谷氨酸组(Glu组)，谷氨酸加免疫血清组(Glu+rAd5/NR2B组)、谷氨酸加正常血清组(Glu+Normal组)。四组神经元培养基中分别加入PBS、谷氨酸、免疫血清加谷氨酸、正常血清加谷氨酸，培养3d，Annexin V-PI双标后通过流式细胞仪检测各组中神经元的凋亡，并利用免疫组织化学染色的方法观察活化Caspase-3的表达水平。结果：①大鼠经rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫4周后，能在血清中发现较高滴度的NR2B特异性抗体(12．7±2．8μg/ml)。Fluo-4/AM标记的原代神经元经激光扫描共聚焦显微镜观察发现，经谷氨酸刺激后神经元胞内钙浓度明显升高，rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫血清能逆转谷氨酸的这种升高作用；而且，经免疫血清处理后的神经元在谷氨酸的作用下，胞内钙浓度变化不大；但是，正常大鼠血清却对神经元胞内钙浓度没有影响。②Annexin V-PI双标流式细胞仪检测结果表明：与Glu组相比，加入正常血清和免疫血清后神经元凋亡率均增高(P＜0．05)；但正常血清组神经元凋亡率增高更加明显(P＜0．05)。活化Caspase-3表达水平的检测结果显示：与Glu组相比，Glu+rAd5/NR2B组和Glu+Normal组中活化caspase-3阳性神经元数目增加(P＜0．05)；与Glu+Normal组比较，Glu+rAd5/NR2B组中活化caspase-3减少(P＜0．05)。2．rAd5/NR2B镇痛疫苗对大鼠体内神经元凋亡的影响方法：实验分为6组(n=10)：空白对照组(Naive组)、单纯rAdS/NR2B干预组(rAd5/NR2B组)、假手术组(Sham组)、SNI模型组(SNI组)、MK801处理的SNI模型组(SNI+MK801组)和rAd5/NR2B处理的SNI模型组(SNI+rAd5/NR2B组)。其中，Naive组不做任何处理；rAd5/NR2B组通过灌胃的方法注射rAd5/NR2B镇痛疫苗(1×10~8PFU)，2周后重复注射；SNI组和SNI+MK801组先构建SNI慢性神经病理性疼痛模型，1周后再分别隔天腹腔注射生理盐水和MK801(1mg/kg)；SNI+rAd5/NR2B组先通过灌胃的方法注射rAd5/NR2B镇痛疫苗(1×10~8 PFU)，2周后重复注射，再1周后构建SNI疼痛模型；Sham组只暴露坐骨神经的分支，不结扎。SNI模型构建后检测大鼠的机械缩爪阈值(Mechanical Withdrawal Threshold，MWT)和热痛缩腿时间(Thermal Withdrawal Duration，)，评价rAd5/NR2B的镇痛效果。取大鼠海马和脊髓组织，通过免疫组织化学染色和Western blot的方法分别检测大鼠脊髓和海马活化Caspase-3蛋白的表达水平。结果：SNI模型建立前各组大鼠间MWT和TWD比较差异无统计学意义(P＞0．05)。SNI模型建立后2周，与SNI组相比，SNI+rAd5/NR2B组和SNI+MK801组大鼠MWT增高，TWD缩短(P＜0．05)，这种差异可持续至SNI术后42天。SNI模型建立后3周，SNI+MK801组大鼠MWT较SNI+rAd5/NR2B组增高，TWD缩短(P＜0．05)。脊髓切片经免疫组化染色后显示，与Naive组相比，rAd5/NR2B组、Sham组、SNI组和SNI+rAd5/NR2B组中脊髓和海马组织中活化Caspase-3阳性细胞数目变化差异无统计学意义(P＞0．05)，而SNI+MK801组中活化Caspase-3阳性细胞数目增加(P＜0．05)。Western blot检测结果显示：与SNI组相比，SNI+rAd5/NR2B组海马组织中活化Caspase-3的表达水平无明显变化(P＞0．05)，但SNI+MK801组中Caspase-3的表达水平升高(P＜0．05)。3．rAd5/NR2B镇痛疫苗对大鼠认知功能的影响方法：取雌性SD大鼠(体重200g左右)60只，分组与处理同实验第二部分。SNI模型构建后1周所有大鼠一起进行Morris水迷宫检测。第1～5天进行定位导航实验。记录大鼠自入水到找到平台后四肢爬上平台时所需的时间，即潜伏期(若在规定时间内未找到平台，按60s计算)，同时记录寻找平台的游泳速度。第6天入水点改为平台所在象限的毗邻左侧象限，每只大鼠进行2次平台实验，记录大鼠的潜伏期和游泳速度。之后测定大鼠的空间探索能力，撤去水中的平台，记录60s内大鼠穿越平台的次数。水迷宫实验结束后，断头取脑，利用免疫组织化学染色和Western blot的方法检测大鼠海马组织中NR2B的表达水平。结果：①Morris水迷宫实验中，与Naive组相比，rAd5/NR2B组和Sham组中大鼠的潜伏期和穿越平台次数无明显变化(P＞0．05)，SNI组、SNI+rAd5/NR2B组和SNI+MK801组中大鼠的潜伏期延长，穿越次数减少(P＜0．05)中。与SNI组相比，SNI+rAd5/NR2B组的潜伏期没有增加，穿越次数也没有缩短(P＞0．05)，而利用MK801镇痛后大鼠的潜伏期延长，穿越次数减少(P＜0．05)。6组大鼠的游泳平均速度比较差异无统计学意义(P＞0．05)。②免疫组织化学染色和Western blot检测发现：与Naive组相比，rAd5/NR2B组、Sham组和SNI+rAd5/NR2B组中大鼠海马组织中NR2B蛋白的表达水平无明显变化(P＞0．05)，而SNI组中NR2B表达水平增高(P＜0．05)，SNI+MK801组中表达水平下降(P＜0．05)。与SNI组相比，SNI+rAd5/NR2B组中NR2B表达水平下降(P＜0．05)，而SNI+MK801组下降更明显(P＜0．05)。4．rAd5/NR2B镇痛疫苗影响大鼠认知功能的电生理学和分子学机制方法：取雌性SD大鼠(体重200g左右)36只，分为6组(n=6)：Naive组、rAd5/NR2B组、Sham组、SNI组、SNI+MK801组和SNI+rAd5/NR2B组。每组的处理同实验第二部分。SNI模型构建后2周，断头取脑，制备海马脑片，记录大鼠海马CA1区兴奋性突触后电位(Field Excitatory Postsynaptic Potential，fEPSP)的变化。利用诱发最大幅度fEPSP 30～40％的刺激电压作为单刺激，并稳定刺激20min以上，记录fEPSP曲线，作为fEPSP的基础值。给予强直刺激(High-frequency stimulation，HFS)后记录fEPSP幅度和斜率的变化，如增加20％并持续30min以上视为LTP诱发成功，同时比较各组大鼠的LTP幅度，依此评价rAd5/NR2B镇痛疫苗对大鼠LTP的影响。电生理实验结束后，提取海马组织中总蛋白，利用Western-blot的方法检测磷酸化Tau蛋白和NR2B蛋白的表达水平。结果：①在电生理实验中，与Naive组相比，rAd5/NR2B组、Sham组和SNI组中大鼠海马CA1区fEPSP和LTP幅度均无明显变化(P＞0．05)，但SNI+rAd5/NR2B组中海马脑片经HFS处理后虽成功诱发出LTP，但LTP幅度下降(P＜0．05)，SNI+MK801组中，海马CA1区LTP幅度明显下降，不仅低于SNI+rAd5/NR2B组(P＜0．05)，甚至低于20％，视之为LTP诱发不成功。②海马磷酸化Tau蛋白Western blot检测发现：6组中大鼠海马组织中磷酸化tau蛋白的表达水平差异无统计学意义(P＞0．05)。③海马NR2B蛋白Westernblot检测发现：与Naive组相比，rAd5/NR2B组、Sham组、SNI+rAd5/NR2B组和SNI+MK801组中大鼠海马组织中NR2B蛋白的表达水平无明显变化(P＞0．05)，而SNI组中NR2B表达水平增高(P＜0．05)，SNI+MK801组中表达水平下降(P＜0．05)。与SNI组相比，SNI+rAd5/NR2B组中NR2B表达水平下降(P＜0．05)，而SNI+MK801组下降更明显(P＜0．05)。5、统计学处理采用SPSS13．0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差((?)±S)表示，组内比较采用重复变量数据方差分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。研究总结一主要研究结果1．大鼠经rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫4周后，产生较高滴度的NR2B特异性抗体，后者能够抑制或逆转谷氨酸造成的钙超载。rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫血清与正常血清相比，能够减少谷氨酸诱导的原代神经元凋亡。2．在体实验中，rAd5/NR2B镇痛疫苗不会诱发在体脊髓和海马神经元的凋亡，但MK801却增加了大鼠脊髓和海马神经元的凋亡。3．通过Morris水迷宫实验发现，经rAdS/NR2B镇痛疫苗免疫后大鼠的潜伏期、穿越平台次数没有显著变化，MK801则明显延长了大鼠的潜伏期，穿越平台的次数减少。rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫后的SNI大鼠NR2B表达水平下降。4．正常大鼠经rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫后海马CA1区LTP幅度无明显变化。但疼痛模型大鼠经免疫后，fEPSP斜率以及LTP幅度降低，MK801则显著降低fEPSP斜率，LTP诱发不成功。rAd5/NR2B镇痛疫苗对tau蛋白的磷酸化水平无明显影响，而注射MK801后Tau蛋白的磷酸化水平增高。rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫后的SNI大鼠NR2B表达水平下降。二研究结论1．大鼠经rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫后产生含较高滴度NR2B特异性抗体的免疫血清，该免疫血清能抑制或逆转谷氨酸造成的钙超载，并减少谷氨酸诱导的原代神经元凋亡，对神经元具有一定的保护作用。2．rAd5/NR2B镇痛疫苗不会增加体内海马和脊髓神经元的凋亡。3．rAd5/NR2B镇痛疫苗对大鼠的空间学习与记忆功能没有明显的损害。4．rAd5/NR2B镇痛疫苗一定程度上降低了大鼠LTP的诱导和维持，但对tau蛋白的磷酸化水平无明显影响。本研究中，我们发现rAd5/NR2B镇痛疫苗能够对谷氨酸诱导的体外神经元凋亡产生一定的保护作用，同时对在体神经元的凋亡、大鼠的认知功能以及tau蛋白的磷酸化没有明显影响；电生理和分子学机制研究显示，rAd5/NR2B镇痛疫苗削弱了大鼠LTP的诱导和维持，而且降低了NR2B的表达水平。这表明经rAd5/NR2B镇痛疫苗免疫所产生的NR2B特异性抗体，能够拮抗NR2B并下调NR2B蛋白表达水平，以发挥镇痛作用，并影响到神经元的突触可塑性，但其幅度有限，不足以诱发在体神经元的凋亡，也不足以影响到大鼠的认知功能。这些结果证明rAd5/NR2B镇痛疫苗应用大鼠镇痛是安全的，相比其他NMDA受体拮抗剂有明显的优势。三展望rAd5/NR2B镇痛疫苗应用于神经病理性痛大鼠有良好的镇痛效果，是一种新颖、有效的镇痛方法。同时，rAd5/NR2B对大鼠的生理功能没有明显影响，安全性较高，具有极大的临床推广价值。但是，我们的观察仅仅限于动物实验水平，且观察的时间有限，因此仍需要更客观更全面的观察和评价。