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前言肺缺血再灌注损伤临床上常见于肺移植术、体外循环手术、肺栓塞溶栓治疗和休克等,缺血再灌注损伤导致的肺功能不全是肺移植术后死亡的主要原因,也是影响体外循环病人预后、住院时间的重要因素。休克、心肺复苏及肺外组织器官缺血时肺再灌注损伤是病程早期出现呼吸功能不全的主要原因。肺缺血再灌注损伤在临床多见,探寻其发生机制和有效可行的防治方法是近年来人们研究的热点方向。大量的研究认为氟烷、安氟醚、异氟醚、七氟烷等对心肌、脑、肝、肾脏再灌注损伤具有保护作用。关于吸入麻醉药对再灌注后肺组织影响的研究较少,且研究结果也不一致。Nielsen等发现地氟醚增加主动脉钳夹再灌注后肺泡毛细血管膜的通透性。陈艳平等研究表明异氟醚减轻离体兔肺模型缺血再灌注后肺水肿。七氟烷具有麻醉诱导、苏醒迅速,血流动力学稳定的特点,在临床上得到广泛应用。七氟烷对正常状态下肺组织形态并无影响,对缺血再灌注后肺组织的作用还有待于进一步研究。缺血再灌注后肺损伤主要表现为肺血管通透性增强,肺水含量增多。近年来随着分子生物学的进展,对血管通透性的形成机制有了更深入的认识。内皮和上皮细胞之间的裂隙是液体、大分子物质透出的主要途径。细胞连接,尤其是紧密连接（TJ,tight junction）,结构和功能的完整性对维持肺组织通透性具有重要意义。本研究拟通过建立在体大鼠肺缺血再灌注损伤模型,观察缺血和再灌注不同时点肺血管通透性和病理形态学变化,并从生化、分子生物学水平探讨缺血再灌注后肺损伤和七氟烷肺保护的可能机制,为临床预防和治疗肺缺血再灌注损伤合理选择用药提供理论依据。本研究分为三部分;1、七氟烷对缺血再灌注后大鼠肺组织通透性的影响;2、七氟烷对缺血再灌注后大鼠肺组织TNF-α和PKC-α表达的影响;3、七氟烷对缺血再灌注后大鼠肺组织紧密连接蛋白occludin和ZO-1的影响。实验材料一、实验动物健康雄性wistar大鼠96只,体重250g～350g。二、实验主要试剂及药品七氟烷（Baxter公司,美国）抗PKC-α一抗（Sigma公司,美国）抗occludin一抗（Santa-Cruz公司,美国）抗ZO-1一抗（Santa-Cruz公司,美国）蛋白提取试剂盒（南京凯基生物公司）RT-PCR试剂盒和DNA聚合酶（TaKaRa公司,日本）引物（TaKaRa公司,日本）RNA提取试剂盒、RNA裂解液（上海生工公司）三、实验主要仪器西门子监护仪（Sirecust730,德国）微量输液泵（Braun公司,德国）Detax气体监护仪（芬兰）Drager麻醉机（美国）动物呼吸机（浙江）飞力普透射电镜（CM-10型,德国）超薄切片机（8800型,瑞典）紫外分光光度计（岛津UV-260型,日本）电泳仪（BIO-RAD-PAC300型,美国）电泳槽（BIO-RAD mini,美国）转印槽（Tanon,天津）组织超声匀浆器（UP200H,美国）高速台式冷冻离心机（Heraeus-Biofuge-PrimoR,德国）PCR扩增仪（TaKaRa TP-600,日本）凝胶成像分析系统（Tanon GIS-2020,天津）实验方法一、动物模型参照改良的Eppinger方法建立在体大鼠肺缺血再灌注损伤模型。雄性wistar大鼠,20%乌拉坦3.3ml.kg-1腹腔注射麻醉,左开胸后阻断肺门45min,开放血流再灌注。二、实验分组对照组（C）;开胸游离左肺门,未行肺门阻断;缺血再灌注组（IR）;阻断左肺门45min后开放血流再灌注;七氟烷组（Sev-C）;吸入七氟烷30min后游离左肺门,未行肺门阻断;七氟烷缺血再灌注组（Sev-IR）;吸入七氟烷30min,左肺门阻断45min后开放血流再灌注。每组包括3个时点;缺血阻断45min、再灌注60min、再灌注120min,其中再灌注120min时另外有6只大鼠行支气管灌洗,收集支气管灌洗液。三、观察指标和方法1)血流动力学变化2)肺组织病理检查（光镜）;肺泡和毛细血管超微结构的检查（电镜）。3)肺水含量（W/D）4)肺组织和支气管灌洗液蛋白含量（化学法）。5)肺组织TNF-α含量（ELISA法）6)PKC-α在细胞膜和胞浆的表达;occludin和ZO-1在肺组织的表达（western-blot法）7)occludin和ZO-1mRNA表达的变化（RT-PCR法）8)occludin和ZO-1在细胞内的定位（免疫组化法）四、统计学处理所有数据采用SPSS11.5统计学分析软件进行处理,测定结果用均数±标准差（（?）±S）表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Student-Newman-Keuls方法检验,P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果一、七氟烷对缺血再灌注后大鼠肺组织通透性的影响1、血流动力学变化各组在缺血和再灌注期间MAP平稳。IR和Sev-IR组再灌注后SpO2逐渐下降（P＜0.05）,两组间无明显差异（P＞0.05）,再灌注60min和120min比较SpO2差异无统计学意义（P＞0.05）。2、肺组织通透性的改变IR组和Sev-IR组再灌注后W/D、肺通透指数明显升高（P＜0.05）,再灌注120min达到峰值。Sev-IR组的变化低于IR组（P＜0.05）。3、光镜检查IR组肺毛细血管扩张充血,肺泡间隔水肿增宽,间质炎性细胞浸润,肺泡腔内红细胞、炎性细胞渗出。随着再灌注时间的延长,损伤改变逐渐加重。Sev-IR组病理改变和IR组比较明显减轻,间质和肺泡腔内渗出减少。4、电镜检查IR组再灌注120min时内皮细胞间紧密连接带断开、结构松散。Sev-IR组再灌注120min相邻的内皮细胞间质膜紧靠,未见缝隙,无紧密连接断裂。各组肺泡上皮细胞间的紧密连接均保持完整。二、七氟烷对缺血再灌注后大鼠肺组织TNF-α和PKC-α表达的影响1、IR组再灌注后肺组织TNF-α含量明显增加（P＜0.05）,再灌注120min达峰值。Sev-IR组TNF-α上升的程度明显低于IR组（P＜0.05）。2、IR组再灌注后肺组织PKC-α在细胞膜表达增加（P＜0.05）,细胞浆的表达减少（P＜0.05）,再灌注120min变化最显著。Sev-IR组PKC-α在细胞膜表达增加、胞浆减少的程度都低于IR组（P＜0.05）。三、七氟烷对缺血再灌注后大鼠肺组织occludin和ZO-1表达的影响1、TJ蛋白表达的差异IR组再灌注后occludin光密度值明显降低,再灌注120min达最低值（P＜0.05）。ZO-1光密度值也同步下降（P＜0.05）。Sev-IR组occludin和ZO-1光密度值下降的程度明显低于IR组（P＜0.05）。2、TJ蛋白mRNA水平的差异IR组occludin/β-actin光密度比值再灌注后明显降低,再灌注120min时比值最低（P＜0.05）。ZO-1/β-actin光密度比值再灌注后也同步下降,120min达最低值（P＜0.05）。Sev-IR组occludill/β-actin和ZO-1/β-actin下降程度明显低于IR组（P＜0.05）。3、TJ蛋白在细胞内的定位IR组occludin和ZO-1染色明显变浅,再灌注120min最显著（P＜0.05）。Sev-IR组TJ蛋白染色变浅程度减轻（P＜0.05）。Occludin和ZO-1定位于细胞膜和靠近胞膜的胞浆,在血管内皮细胞和肺泡上皮细胞都可见染色,在相邻细胞间着色更深。结论1、缺血再灌注后大鼠肺组织通透性增加,七氟烷预处理使组织通透性下降,对再灌注后肺组织有保护作用。2、肺组织再灌注后TNF-α释放增加,七氟烷预处理抑制肺组织TNF-α产生。3、PKC-α移位和激活参与介导缺血再灌注后肺组织损伤。4、TJ蛋白occludin、ZO-1 mRNA和蛋白表达下降是肺缺血再灌注后血管通透性增加的主要机制。七氟烷的肺保护作用可能是通过其抑制TNF-α释放和PKC-α移位,从而减弱occludin和ZO-1 mRNA和蛋白表达下调所致。