研究背景艾滋病号称“世纪瘟疫”,是人类社会最重大的传染病之一。据统计,截至2011年12月,全球艾滋病患者总数约为3400万人,非洲和亚洲仍然是艾滋病患者最为集中的地区。我国的艾滋病感染情况也不容乐观,自1985年发现第一例感染者以来,至2011年底,估计现存艾滋病感染者和病人约78万,其中艾滋病病人15.4万人；全国艾滋病感染人数逐年上升,且艾滋病病毒传播出现从高危人群向一般人群扩散的趋势。近几年随着检测力度的加大,新报告HIV阳性人数更是以每年30%的速度递增。作为全国疫情最严重的地区之一,广东已有HIV感染者和病人逾4万,同时早期的HIV感染者,目前正逐渐进入发病高峰。以深圳市为例,近七年来(2004-2011)在治艾滋病病人数量增长了整整16倍!国务院最新发布的《中国遏制与防治艾滋病“十二五”行动计划》明确要求“减少艾滋病新发感染,降低艾滋病病死率”,预计今后几年艾滋病治疗的任务将更加艰巨。要提高治疗质量,降低艾滋病病死率,早发现、早诊断、早治疗非常关键。艾滋病患者有一些典型的口腔表现,如口腔白色念珠菌感染等,往往是艾滋病患者最早期的先发症状之一。因此,研究艾滋病人群的口腔表征就显得非常有意义。而目前国内对于艾滋病患者口腔方面的研究报道较少,口腔念珠菌的感染状况和耐药性的情况研究更少。念珠菌属于真菌的一种,在正常健康人群的口腔中广泛存在。它是条件致病菌,在一定条件下,会变为致病菌。如免疫力低下者、儿童、老年人,以及长期用药、放疗、化疗者,体内菌群失调者等。近年来,由于广谱抗生素的大量使用引起菌群失调、二重感染,以及免疫抑制剂的使用、长期抗肿瘤的化疗等因素,特别是艾滋病、吸毒人群的扩大,使真菌感染的机会大大增加。艾滋病导致人体免疫细胞缺陷,其口腔内念珠菌容易检出。有研究表明,艾滋病患者口腔的念珠菌检出率及毒力都较健康人高。口腔念珠菌感染已成为艾滋病人口腔最早期最主要的病理表现。且深部真菌感染的高致死率也是造成艾滋病患者最终死亡的主要原因之一。在临床上,由于患者长期服药,依从性不佳,以及抗真菌药物的不规范使用等因素,临床耐药真菌菌株不断增加,耐药机理日趋多样化,顽固、重复感染的病例增多。目前,由条件致病菌导致的真菌感染已成为AIDS患者最常见、比例最大的机会性感染,同时也是其最重要的致死原因之一。调查表明,艾滋病患者合并真菌感染不仅已有耐药现象存在,部分抗真菌药物还可能影响艾滋病患者的抗HIV病毒治疗,因此成为治疗上的一大难题。随着研究的深入,艾滋病人口腔念珠菌的感染菌种也越来越多的被发现和关注,除了检出率最高的白色念珠菌外,艾滋病人口腔内也容易检出克柔念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌。且有多个念珠菌菌种共存的情况。据国外资料报道,HIV感染者在其病程中罹患真菌感染的可能性为90%。感染的真菌几乎包括了所有已知的致病真菌和某些对正常的宿主来说是非致病的真菌。口腔念珠菌感染,与全身多个脏器的念珠菌感染密切关联。因此了解HIV感染者和AIDS患者口腔念珠菌的菌种分布也对研究口腔念珠菌病的发生发展有着重要的意义。随着我国对艾滋病防治工作的日益重视和投入加大,部分艾滋病疫情重、机会性感染发生率高的省份(如广西),已决定开始为艾滋病感染者提供免费的抗真菌治疗药物。初步估计,每名获准免费治疗的患者一年需投入上万元,这个政策一旦在全国推广,涉及金额将十分庞大。因此,HIV感染者和AIDS患者的真菌感染状况、耐药基线水平,以及如何选择抗真菌药物种类的问题,是事关政府对卫生经济方面的决策。综上所述,了解这一群体真菌的感染、耐药状况,及其对抗病毒(HIV)治疗的影响,对降低艾滋病临床漏诊率,改善患者生存质量,提高临床合理用药水平具有重要意义。本研究以已确诊的HIV感染者和AIDS患者(以下均简写为HIV/AIDS患者)为调查对象,对其口腔内分离到的念珠菌作菌种及抗真菌药物的敏感性分析,了解目前各菌种所占比例,及其对抗真菌药物的敏感程度,为临床提供更安全合理的用药指导,为政府决策提供科学依据。并为以后进一步作真菌耐药菌株基因型分析,从分子水平研究耐药机理奠定基础。本研究不仅对AIDS合并机会性真菌感染尤其是顽固病例的诊治,预防具有较强的应用价值,而且对于其他原因导致的口腔真菌感染的诊治,乃至医院院内感染的监控,以及新型抗真菌药物的研制具有潜在意义。第一章HIV/AIDS患者口腔念珠菌的培养和鉴定一、方法(一)HIV/AIDS患者口腔念珠菌的采集和培养将采集到的HIV/AIDS患者口腔黏膜拭子,直接接种于CHROMagar念珠菌显培养基平板上,2小时内送实验室培养。(二)念珠菌的观察和鉴定1. CHROMagar念珠菌显色培养基上的形态观察肉眼观察CHROMagar念珠菌显色培养基平板上生长的各个菌种的形态,菌落数目,颜色。2.显微镜下的形态学观察观察标本革兰染色后的显微镜下形态,明确是念珠菌后,再进行菌种分纯、增菌。3.API20C AUX鉴定系统使用法国生物梅里埃公司API20C AUX真菌鉴定系统对分纯、增菌后的念珠菌鉴定到种。二、结果(一)HIV/AIDS患者口腔念珠菌的培养将口腔黏膜拭子直接接种于CHROMagar念珠菌显色培养基上,放入37℃恒温箱,24-48小时后观察生长结果,未见生长物的继续培养至7天。(二)念珠菌的观察和鉴定1.念珠菌的形态学观察在CHROMagar念珠菌显色培养基上,根据菌株生长情况,颜色的不同来初步鉴别念珠菌的种类：绿色或翠绿色的为白色念珠菌或都柏林念珠菌；热带念珠菌菌落为蓝灰色或铁蓝色；克柔念珠菌菌落为粉红色,边缘模糊,有微毛；光滑念珠菌落为紫色；其他念珠菌菌落为白色。并可观察到多个菌种的混和生长的现象。2.显微镜下的形态学观察挑取培养基上的菌株,在革兰染色下,直接进行显微镜下检查,发现有孢子及菌丝均肯定为念珠菌3.念珠菌的菌种检出情况使用API20C AUX鉴定系统可直接将念株菌鉴定到种。574例HIV/AIDS患者中共检出念珠菌159例,共170株。其中,以白色念珠菌为多,133株；其次分别是克柔念珠菌19株、近平滑念珠菌5株、无名念珠菌5株、热带念珠菌5株、光滑念珠菌3株等。其中单一生长的念珠菌146例,两种或两种以上菌种共生的共13例。4.念珠菌的检出率与CD4+T细胞数目的关系按近期CD4+T细胞计数检测结果,将574例HIV/AIDS患者以CD4+T细胞数目<200个／μl和≥200个/μl分为为两组,比较两组的念珠菌的检出率,发现两组念珠菌的检出率差异显著,有统计学意义(x2=41.689,P=0.000)。CD4+T细胞数目小于200个/μl的患者口腔念珠菌的检出率高于CD4+T细胞数目大于等于200个/μl的患者。三、结论在本实验中,HIV/AIDS患者口腔念珠菌的检出率约为27.70%,绝大多数为白色念珠菌(83.65%),其次为克柔念珠菌,热带念珠菌,近平滑念珠菌等,且有多菌种共生的情况。CD4+T细胞数目越多,口腔念珠菌的检出率越低。第二章健康人口腔念珠菌的培养和鉴定一.方法(一)健康人口腔念珠菌的收集和培养同实验第一部分(二)念珠菌的观察和鉴定同实验第一部分二、结果(一)健康人口腔念珠菌的培养将健康人口腔黏膜拭子直接接种于CHROMagar念珠菌显色培养基上,放入37℃恒温箱,24-48小时后观察生长结果,未见生长物的继续培养至7天。(二)念珠菌的观察和鉴定同实验第一部分(三)念珠菌的检出情况和菌种分布本组574例健康人口腔中,可检出有念珠菌生长的73例,念珠菌的总检出率为12.72%。其中单独生长的白色念珠菌61例,克柔念珠菌7例,近平滑念珠菌2例,光滑念珠菌1例,无名念珠菌1例,两种或两种以上念珠菌共生的共1例。与第一章HIV/AIDS患者口腔念珠菌的检出率和共生菌的检出率经统计学方法比较有显著差异(x2=39.954,P=0.000；x2=10.413,P=0.002),HIV/AIDS患者口腔念珠菌的检出率和共生菌的检出率显著高于健康人对照组。而检出的不同种念珠菌占检出总念珠菌的比例两组无显著性差异。三、结论HIV/AIDS患者口腔念珠菌的检出率和共生念珠菌的检出率高于健康人对照组,检出的不同种念珠菌占检出总念珠菌的比例两组无显著性差异。第三章HIV/AIDS患者口腔念珠菌的体外药物敏感性实验及耐药性研究一.方法将实验一检出的已鉴定到种的念珠菌继续分纯,增菌,培养(方法同实验一)后,置于ATB FUNGUS3药敏试剂盒,培养、比对,根据5种抗真菌药物的CLSI/NCCLS推荐的念珠菌属的MIC分界点进行药物敏感性的判断。二.结果133株白色念珠菌,对5-氟胞嘧啶和两性霉素B均敏感,对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的耐药率分别是66.17%,81.20%,74.44%；19株克柔念珠菌,对5-氟胞嘧啶均敏感,对氟康唑天然耐药,对两性霉素B,伊曲康唑,伏立康唑的耐药率分别是5.26%,15.79%,5.26%；5株近平滑念珠菌,对5种药物均敏感；5株无名念珠菌,对伊曲康唑的耐药率为40%,对其他4种均敏感；5株热带念珠菌,对5-氟胞嘧啶均敏感,对两性霉素B,氟康唑,伊曲康唑,伏立康唑的耐药率分别是20%,20%,80%,80%。三.结论对几种念珠菌的体外药物敏感实验表明,检出率最高的白色念珠菌对5-氟胞嘧啶和两性霉素B均敏感,对氟康唑,伊曲康唑,伏立康唑的耐药率高。