在中枢神经系统内，生理水平的NO是一种胞内信使分子，对维持正常生理活动有着重要的作用。高浓度的NO可产生神经毒性，导致多种神经系统疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、脑血管病等。研究认为，NO既可以诱导细胞凋亡，也可以引发细胞坏死，其中，凋亡又为主要途径。因此选择阻断这种凋亡途径从而改变疾病的进程为本实验的根本目的。 基因治疗即是指将治疗基因递送至细胞内，通过基因转录、翻译、蛋白质合成、最后由合成的蛋白质产生治疗效应。在基因治疗中，安全、有效的目的基因是关键。以往，抗凋亡基因研究多集中在Bcl—2上，但仍有研究发现，导入Bcl—2基因后并没有抑制细胞凋亡，反而促进了凋亡，他们认为Bcl—2在不同细胞中凋亡的作用是有差别的。Bcl—xl的结构和Bcl—2相似，在多种细胞中扮演抑制凋亡角色。国内外已有学者将其应用于抗神经细胞凋亡的各种研究中，并取得良好效果。Gonzalez—Garcia M等研究还发现Bcl—2在成熟的中枢神经系统的表达水平明显较Bcl—xl低很多，他们认为，Bcl—x蛋白在中枢神经系统保护神经元方面可能发挥着重要的作用。因此，本研究选择Bcl—xl基因作为研究对象，探索其对抗NO毒性的作用。 在模型的选择上，考虑到人类中枢神经系统的难接近性及原代培养神经元的不可增殖性，研究中最终选择人神经母细胞瘤细胞SH—SY5Y细胞做为工具。SY5Y是来源于人神经母细胞瘤的细胞，其细胞形态、生理和系列化功能与正常神经细胞相似，适合于作为神经损伤细胞模型，被广泛的用于中枢神经系统疾病研究。 本课题从人类胎盘组织中克隆出抗凋亡基因Bcl—xl，构建出真核细胞表达载体pIRES2-EGFP/Bcl—xl，观察它对硝普钠诱导的SH—SY5Y细胞凋亡是否具有抑制作用，旨在探索Bcl—xl基因阻断NO细胞凋亡损伤的途径。 本课题内容分为三部分： 第一章真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl—xl的构建和鉴定 目的：获取人类抗凋亡基因Bcl—xl，构建Bcl—xl真核表达质粒。 方法： 1、根据人Bcl—xl基因序列自行设计引物，从人类胚胎组织中提取总RNA，RT—PCR获得Bcl—xl cDNA并扩增后，TA克隆，与T载体连接，再转化至DH5α感受态细菌，扩增、提取质粒，测序鉴定。 2、选用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切T载体质粒，回收Bcl—xl片段，与含绿色荧光蛋白基因的pIRES2-EGFP质粒连接，再转化至DH5α感受态细菌，扩增、提取质粒，电泳、测序鉴定。 结果： 克隆的Bcl—xl基因经酶切和测序鉴定正确，并成功与pIRES2-EGFP质粒连接，构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl—xl。 第二章脂质体对SH—SY5Y细胞转染效率及其毒性观察 目的：观察pIRES2-EGFP/Bcl—xl质粒借助Lipofectamine2000对SH—SY5Y细胞的转染效率及脂质体对该细胞的毒性作用。 方法： 1、SH—SY5Y细胞于含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，在5％的CO2、37℃条件下培养。 2、利用Lipo fectamine2000在细胞汇合度70％时行转染。将质粒pIRES2-EGFP/Bcl—xl转染入SH—SY5Y细胞。 3、转染后48h，通过倒置荧光显微镜观测质粒在细胞中的转染效果。 4、细胞转染后，利用流式细胞仪检测质粒转染效率。 5、实验分三组：未转染组、pIRES2-EGFP空质粒转染组和pIRES2-EGFP/Bcl—xl质粒转染组。设定正常对照组细胞存活率为100％，其余各组光密度值与之相比得到各自的MTT细胞存活率。 结果： 1、以未转染组MTT吸光度为对照，将pIRES2-EGFP空质粒转染组和pIRES2-EGFP/Bcl—xl质粒转染组进行MTT检测，发现三者细胞存活率无明显差别(P>0.05)。 2、显微镜下观察，经流式细胞仪检测，转染效率约为63％。 第三章Bcl-xl基因对硝普钠诱导SH-SY5Y细胞凋亡抑制作用的观察 目的：1、观察硝普钠对SH—SY5Y细胞的影响； 2、观察Bcl—xl基因转染入SH—SY5Y细胞后对硝普钠作用的抑制。 方法： 1、硝普钠(SNP)处理细胞：分别用不同浓度的(200umol/L、100umol/L、50umol/L、0umol/L)SNP作用SH—SY5Y细胞24 h，观察各组浓度SNP对细胞的影响，送流式细胞仪检测。并选取50 umol/L为实验浓度。 2、细胞转染并分组：本实验设A：正常组、B： pIRES2-EGFP空质粒转染组、C：pIRES2-EGFP/Bcl—xl质粒转染组，各组细胞生长48h后，分别用50 umol/L SNP行药物诱导。 3、SNP作用各组细胞24h后，Hoechst33258染色后观察核染情况。 4、MTT比色法测定各组细胞活性，设定对照组为正常细胞，未转染，未加药物，存活率为100％，余各组光密度值与之相比得到各自的MTT细胞存活率。 5、提取C组转染前、转染后24h、转染后48h、转染后72h、转染后96h细胞总RNA，行RT—PCR法检测细胞转染后Bcl—xl基因的mRNA转录情况。 6、提取C组转染前、转染后24h、转染后48h、转染后72h、转染后96h细胞总蛋白，用Western blotting检测转染后细胞蛋白表达情况。 结果： 1、光镜下可以观察到，随着SNP浓度的升高，细胞突起回缩或断裂，胞体固缩，呈圆点状，网络消失；流式细胞仪检测也发现，凋亡率逐渐增高，并与浓度有正相关依赖性。与MTT结果相一致。 2、荧光显微镜下观察，Hoechst33258染色后，正常细胞核呈蓝色或淡蓝色，着色均匀；而50umol/L SNP作用的细胞(包括未转染组和空质粒转染组)染色后发现约30％为凋亡细胞(与流式细胞结果相符)：呈核浓染，核固缩或为典型的凋亡小体；而pIRES2-EGFP/Bcl—xl质粒转染组则凋亡细胞明显减少，仅小部分胞核呈浓染状，约10％左右。 3、在SNP作用后，各组细胞行MTT检测，pIRES2-EGFP/Bcl—xl质粒转染组细胞存活率比正常组和pIRES2-EGFP空质粒转染组都要高，差异有统计学意义，P<0.05；而正常组和pIRES2-EGFP空质粒转染组之间存活率则无明显统计学意义，P>0.05。 4、RT—PCR结果：未转染组有很微弱的电泳带，转染24h以后时间点电泳带都明显增强，而其中转染后48h最强，均在700bp附近。 5、Western blotting结果：未转染组，转染24h组，转染48h组可见弱爆光带，强度一致，而转染72h组，转染96h组见较前三组明显增强爆光带，其中转染72h组亮度最强，位于32KD左右。同时，各组间β—actin强度一致。 结论： 1、证实硝普钠(SNP)对SH—SY5Y细胞具有凋亡效应，而且与剂量有正相关依赖性。 2、Bcl—xl基因在SH—SY5Y细胞中有弱表达，将构建质粒pIRES2-EGFP/Bcl—xl转染入该细胞后48h，转录水平最高，而72h为翻译高峰状态，符合生物学表达规律。 3、在SNP浓度为50 umol/L时，Bcl—xl能部分抑制其凋亡效应。