论文部分内容阅读
目的:炎症小体通路是机体内IL-1β与IL-18成熟与分泌增多的主要途径,炎症小体激活已被证实参与多种免疫相关性疾病的病理生理过程,同时帕金森病近些年来一直被证实与脑内慢性炎症相关,但未见关于炎症小体与帕金森病发生机制的报道。本研究试图探讨帕金森病中炎症小体是否存在并被激活,并进一步探究其激活机制。方法:(1)神经元中采用RT-PCR、westernblot及免疫荧光双标检测炎症小体关键蛋白是否表达;(2)在神经元经典炎症刺激模型、鱼藤酮诱导的帕金森病细胞模型中ELISA及westernblot检测IL-1β及IL-18含量验证炎症小体是否被激活;(3)临床帕金森病患者脑脊液与血清中采用ELISA检测IL-1β及IL-18含量;(4)MPTP药物诱导及转基因帕金森病动物模型中检测黑质区组织运用RT-PCR及westernblot检测IL-1β及IL-18的表达量;(5)加入抑制剂或基因敲除CDK5多水平检测炎症小体指标以验证CDK5是否参与介导帕金森病中炎症小体的激活;(6)结合生物信息学预测、western blot与磷酸化质谱三种方法鉴定POP1是否为CDK5的磷酸化底物;(7)GSTpulldown、双分子荧光互补技术(BiFC)及荧光素酶报告基因检测证明磷酸化的POP1与ASC的结合能力变化与是否参与激活NF-1κB信号通路。结果:(1)RT-PCR、Western blot、免疫荧光双标显示炎症小体关键蛋白NALP3、ASC、caspase-1、IL-1β在神经元中有表达,经典炎症小体诱导药物LPS+AIP刺激神经元能显著增加IL-1β、IL-18的分泌。(2)在Rot诱导的神经元细胞模型中,活化的caspase-1、成熟的IL-1β、分泌的IL-1β与IL-18均升高。(3)RT-PCR、Western blot显示MPTP诱导的PD模型小鼠黑质区IL-1β升高。(4)RT-PCR、Westernblot显示SNCA*A30P*A53T转基因小鼠黑质区IL-1β显著升高。(5)临床PD患者、对照志愿者年龄、性别差异无统计学意义,PD组脑脊液中IL-1β与IL-18含量明显升高,而血清中IL-1β与IL-18含量无差异。(6)Westernblot与ELISA揭示CDK5抑制剂Ros能显著阻断caspase-1的活化、IL-1β的成熟与分泌。(7)ELISA检测发现神经元中特异性敲除CDK5同样能抑制IL-1β的分泌。(8)荧光素酶报告基因显示NF-κB信号通路在CDK5敲除的神经元中被抑制,C/EBP、cAMP-PKA、Glucocorticoid、PKC-Ca2+、TGF-P 通路未受明显影响。(9)Scansite 3beta、GPS 2.0均预测出POP1蛋白Thr16位点能被CDK5磷酸化,Cn3D模拟的三维飘带模型与填充模型显示Thrl6位点位于POP1蛋白表面,POP1蛋白Thr16位点在种属之间具有较高的保守性。(10)体外激酶反应与串联质谱均说明CDK5能磷酸化POP1蛋白Thr16位点,T16A突变型不能被磷酸化。(11)GSTpulldown与双分子荧光互补法均显示模拟磷酸化POP1蛋白T16E组与ASC的结合能力下降。(12)荧光素报告基因检测发现TE组可明显增加NF-κB活性,TA组在cdk5/p25共转下也不能增加其活性。结论:(1)神经元中存在炎症小体表达并可在帕金森病细胞模型中被激活;(2)临床帕金森病患者、帕金森病动物模型中炎症小体被激活;(3)CDK5参与调节帕金森病中炎症小体的激活;(4)CDK5磷酸化POP1蛋白的Thr16位点;(5)POP1被磷酸化后与ASC的结合减少,进而引起炎症小体的激活,同时参与激活炎症小体相关的NF-κB信号通路。