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家兔肠道易受感染,进而导致严重的炎症和随后高的死亡率。肠道中的细菌包括各种共生菌代谢产物和菌体成分可以诱导肠道炎症反应。研究证实革兰氏阴性菌菌体比阳性菌菌体更容易引起炎症。与猪和鸡等单胃动物不同,采食后的家兔各肠段的主要菌门是革兰氏阴性菌拟杆菌,且革兰氏阳性菌乳酸菌在总菌中所占比例很低。本论文比较健康成年猪、鸡和家兔回肠总菌对培养的家兔隐窝细胞及DC炎症反应的诱导作用,并研究本实验室已经筛选的几株兔源乳酸菌对肠道上皮中隐窝细胞和树突状细胞的炎性调节作用,以探讨家兔特有的肠道菌群是否会导致其肠道更易发生炎症,以及乳酸菌是否可缓解炎性反应,且不同乳酸菌的缓解作用是否存在差异,两种不同细胞类型对抗原的炎性反应的差异,为家兔筛选益生菌,提高仔兔免疫力和减少仔兔肠炎发生提供理论依据。主要的研究内容及结果如下:1.试验一从未饲喂抗菌素的健康6月龄关中黑猪、42日龄科宝肉鸡和60日龄成年獭兔回肠中收集内容物,每种动物3个个体的回肠内容物等量混样提取菌群基因组DNA,Illumina HiSeq测序对比分析猪、鸡和家兔回肠总菌组成。结果显示,家兔回肠菌群第一优势菌门是拟杆菌门,占总菌群的百分比为89.32%;猪和鸡回肠菌群最优菌门是厚壁菌门,分别占80.79%和88.50%。三种动物回肠内容物中乳杆菌属丰度分别为19.19%、81.19%和0.72%。Beta多样性指数显示猪和鸡回肠菌群组成接近,家兔与两者差异较大。2.试验二(1)对试验一中猪、鸡及家兔回肠总菌灭活后作用于培养的家兔隐窝细胞,空白对照组添加PBS,热灭活总菌处理隐窝6 h后收集细胞,测定相关基因的表达。结果如下:与对照组相比,猪和鸡回肠灭活总菌显著提高家兔隐窝细胞的TLR2、TLR3和TLR4的表达(P<0.05);家兔回肠总菌能显著提高TLR4的表达(P<0.01)。各处理组对TLR9均无显著影响(P>0.05)。三种总菌均显著提高了促炎性因子TNF-α和IL-6的表达(P<0.05)。鸡回肠总菌对抗炎性因子IL-10的表达刺激作用比其他组显著(P<0.05),且猪和鸡回肠总菌提高了IFN-β的表达(P<0.05),猪回肠总菌比家兔回肠总菌有增加IL-10表达的趋势(P<0.1),但家兔回肠总菌对抗炎因子IL-10的表达没有促进作用(P>0.05),甚至有降低IFN-β表达的趋势(P<0.1)。(2)用实验室前期分离的兔源植物乳杆菌L.p2、干酪乳杆菌L.a1和屎肠球菌E.f2,以及购买的大肠杆菌E.coli K88灭活后对仔兔隐窝细胞进行刺激6 h后收集细胞,测定相关基因的表达。结果如下:三株乳酸菌显著提高了TLR2、TLR3和IFN-β的表达(P<0.05)。大肠杆菌E.coli K88显著提高了TLR4表达(P<0.05)。植物乳酸菌L.p2、屎肠球菌E.f2和大肠杆菌E.coli K88组均显著提高隐窝细胞TNF-α的表达(P<0.05)。各处理均显著提高了IL-6的表达(P<0.05)。植物乳杆菌L.p2和屎肠球菌E.f2显著提高了IL-10的表达(P<0.05),E.coli K88组IL10的表达显著低于对照组(P<0.05)。三株乳酸菌中植物乳杆菌对促炎性因子的刺激作用更强。3.试验三用猪、鸡和家兔回肠总菌及兔源乳酸菌的灭活菌刺激小鼠骨髓源树突状细胞系DC2.4细胞,结果表明:(1)DC2.4细胞受到灭活L.p2刺激后,TLR2、TLR4、TNF-α和IL-10表达随着刺激时间增加呈现先升高后降低的规律,在2 h前后表达量较高。(2)猪、鸡和家兔回肠总菌刺激DC2.4细胞2 h后,猪和鸡回肠菌比家兔回肠菌显著提高TLR3表达(P<0.05)。猪和鸡回肠菌显著提高了TLR2和TLR4的表达(P<0.05),家兔回肠菌有提高TLR2的趋势(P<0.1),但对TLR3无显著影响(P>0.05)。各处理组对TLR9表达无显著影响(P>0.05),均显著提高了TNF-α及IL-10的表达(P<0.05),但家兔回肠总菌对TNF-α表达刺激作用显著高于猪和鸡回肠总菌。鸡回肠总菌显著提高了IL-6和IFN-β的表达(P<0.05),猪回肠总菌有提高IL-6和IFN-β基因表达的趋势(P<0.1),但是家兔回肠总菌对IFN-β的表达无明显的影响(P>0.05)和有提高IL-6基因表达的趋势(P<0.1)。(3)在乳酸菌刺激DC2.4细胞2 h的试验中,与对照组相比,L.p2、L.a1和E.f2显著提高TLR2的表达(P<0.05)。L.a1和E.f2显著提高了TLR3的表达(P<0.05)。E.coli K88显著提高了TLR4和TNF-α的表达(P<0.05)。L.p2和E.f2显著提高了TNF-α基因的表达(P<0.05)。相比对照组,L.a1和E.f2有增加IFN-β的趋势(P<0.1)。E.f2和E.coli K88显著提高了IL-10基因表达(P<0.05)。综上所述,家兔回肠菌群第一优势菌门是拟杆菌门,猪和鸡第一优势菌门为厚壁菌门,且家兔回肠乳酸菌远远低于猪和鸡;与猪和鸡回肠总菌相比,家兔回肠总菌更容易使隐窝和DC2.4细胞处于炎症状态;灭活乳酸菌能够引起细胞免疫反应中抗炎性和促炎性因子的同步表达,有利于维持机体的稳态;综合促炎因子和抗炎因子表达水平,干酪乳杆菌和屎肠球菌比植物乳杆菌更有利于维持隐窝的炎性稳态,但对DC2.4细胞的刺激试验没有获得相同的结论。