目的我国是世界上肝脏和胆道疾病发病率最高的国家之一,外科手术是治疗该系疾病的重要手段。肝叶切除术是肝脏及胆道外科中最常规、应用最为广泛的术式。临床上肝切除手术面临的主要问题是如何有效地控制术中肝脏创面大出血。针对此,自1908年Pringle首先采用入肝血流阻断法切除肝脏以来,迄今已有多种阻断入肝血流方法应用于临床,其中主要包括:第一肝门阻断、单侧入肝血流阻断及全肝血流阻断。这些方法的应用既可有效地控制手术出血量,使术野清晰,又能减少术中医源性损伤机会,并对维持患者血容量,减少手术并发症的发生起到十分重要的作用。但入肝血流阻断后无疑将会给肝脏带来不可低估的热缺血损伤。据此,目前临床上对肝血流阻断时限均持较谨慎的态度,一般以10-15min为宜,并以20min为度。所以,自入肝血流阻断方法应用于临床以来,如何既能最大限度地延长肝门血流阻断时间以确保手术顺利进行,又能有效地减轻肝脏热缺血损伤程度以保证术后肝脏功能的恢复一直是人们探讨的重点内容。随着现代腹部外科的不断进步,肝脏移植技术作为治疗终末期肝病的主要手段已无可非议,我国是世界上肝病发病率最高和因肝病引起肝功能衰竭导致死亡人数最多的国家之一,同时也是接受肝移植患者治疗较多和肝移植发展较快的国家。肝脏缺血再灌注损伤是肝移植不可避免的一个过程,严重时可引起移植肝脏失功、其它器官损伤甚至病人死亡。因此,肝脏缺血再灌注损伤严重影响移植肝脏的存活质量,寻找有效的干预措施是肝移植面临的一项重要课题。肝脏是一对缺血缺氧损伤尤为敏感的器官,肝脏在缺血初期,肝细胞虽可通过无氧糖酵解来代偿其能量不足,但随着缺血时间的延续,胞浆内贮存的能量代谢底物不断耗竭,细胞无氧糖酵解功能也逐渐减退,最终将导致细胞内ATP缺乏,继而引发肝细胞结构及功能损伤。既往我们研究发现,增加缺血前肝细胞糖原含量能有效拮抗家兔肝脏缺血再灌注损伤。但是我们也同时发现,肝细胞糖原含量上升到一定水平后,即使增加葡萄糖的用量,其含量并不增加。业已证实,糖原合成是单糖在酶的催化作用下的聚合反应,糖原合成酶是这一过程的关键酶,其活性常受糖原合酶激酶-3β(GlycogenSynthase Kinase-3β; GSK-3β)的负调控,即GSK-3β通过催化糖原合成酶磷酸化使之失活而阻止糖原合成。因此,抑制GSK-3β可解除其对糖原合成酶的负调节作用,使糖原合成酶磷酸化减少,从而促进糖原的合成。由此,我们推测,抑制GSK-3β的活性有望提高肝脏合成糖原的能力,进而有效减轻肝脏缺血再灌注损伤。基于以上认识,本研究在我们以前的工作基础上,进一步探讨肝细胞内预存糖原拮抗肝脏缺血再灌注损伤的机制,澄清GSK-3β在肝脏缺血再灌注损伤过程的作用及其机理,以及GSK-3β抑制剂对肝缺血再灌注损伤的干预效应。方法采用Lewis大鼠为实验动物,进行下列三方面研究。1.制备糖原含量显著不同的三组大鼠肝脏模型,阻断肝脏血流30min后恢复肝血流,分别于恢复血流后1、4、12及24h,测定血清ALT、AST含量、肝组织形态学观察、原位末端脱氧核苷酸转移酶法(TUNEL法)检测肝细胞凋亡、实时定量PCR方法检测肝细胞Bcl- 2 mRNA转录水平、观察动物的1周生存率。2. Lewis大鼠56只随机分为正常组、假手术组和缺血再灌注组。后两组分别于关腹或恢复血流后1、12及24 h,测定血清ALT、AST含量、肝组织形态学观察、TUNEL法检测肝细胞凋亡、采用免疫组织化学法检测肝组织原位GSK-3β的表达、透射电镜观察肝组织结构。正常组直接开腹取标本检测上述指标。3. Lewis大鼠64只随机分为4组,A组(假手术+空白对照),B组(假手术+TDZD-8)、C组(缺血再灌注+空白对照)和D组(缺血再灌注+TDZD-8)。C组、D组阻断肝门血流30 min后恢复肝脏血流。C组、D组分别于恢复血流后2、12 h,A组、B组于关腹后2、12h分别测定血清ALT、AST含量、肝组织形态学检测、TUNEL法检测肝细胞凋亡、采用实时定量PCR方法检测肝细胞Bcl-2mRNA转录水平。结果1.在肝脏缺血前预先给予大鼠高浓度的葡萄糖可增加肝细胞的糖原含量。缺血前肝细胞糖原含量越高,于缺血再灌注期各时相点肝组织结构受损越轻;血清ALT、AST含量及肝细胞凋亡指数越低(P<0.05);Bcl-2mRNA转录水平越高(P<0.05);动物1周生存率越高(P<0.05)。2.缺血再灌注组大鼠在恢复血流后的各时相点,GSK-3β的表达强于正常组和假手术组(P<0.05),肝细胞凋亡指数、血清TNF-α含量也高于正常组和假手术组(P<0.05);肝组织原位GSK-3β表达越强,肝细胞凋亡指数越高;GSK-3β表达光密度值与肝细胞凋亡指数呈显著性正相关;缺血再灌注组大鼠肝组织电镜下可见明显的凋亡小体。3. D组在恢复血流后各时相点与C组同时相点、A组和B组关腹后同时相点比,肝组织结构受损程度显著减轻,血清ALT、AST含量及凋亡指数显著降低(P<0.05);而Bcl-2 mRNA转录则显著上升(P<0.05)。结论1.缺血前增加肝细胞糖原含量可显著减轻肝脏缺血再灌注损伤程度,其机理与上调抗凋亡基因Bcl- 2mRNA转录水平,抑制肝细胞凋亡有关。2. GSK-3β的过量表达参与了大鼠的肝脏缺血再灌注损伤过程,其机制可能与GSK-3β活化NF-κB,使血清TNF-α水平升高有关。3. GSK-3β抑制剂可显著减轻肝脏缺血再灌注损伤程度,其机制与其促进肝细胞糖原合成,上调抗凋亡基因Bcl-2mRNA转录水平,进而抑制肝细胞凋亡有关。