第一部分 慢性肝病患者组织cDNA文库的构建及鉴定 中国是乙型肝炎病毒感染的高发区,慢性HBV感染者达总人口的10%。乙肝病毒感染人体的自然过程即是一系列的肝损害、恶化和缓解的过程。HBV的复制并不会直接对肝细胞造成损害,现在认为在感染的肝细胞中,宿主的免疫系统对病毒抗原的反应是肝损害的决定因素,机理不完全清楚。 慢性乙型肝炎病毒感染是一个严重的临床问题,因为它分布范围广泛,预后可能很差,慢乙肝反复发作,可进展为肝功能失代偿、肝硬化和/或原发性肝细胞癌。慢乙肝发病的分子机理及从初期的慢乙肝发病到肝病终末期肝衰竭的分子机理亦不十分清楚。 构建cDNA文库,可为发现新基因和研究基因功能打下基础。cDNA不象基因组DNA含有内含子而难以表达,因此可以从cDNA文库中采用EST大规模测序、SEREX、酵母双杂交及噬菌体展示等方法来筛选到所需要的目的基因,并可肝硬化及直接用于该目的基因的表达。 因此,构建慢乙肝、乙肝原发性肝癌组织cDNA文库,并进一步筛选克隆,将有助于了解慢乙肝、乙肝肝硬化及原发性肝癌组织的基因表达谱,筛查与与这些疾病的发生特异相关的基因和蛋白，从而为探讨慢乙肝、乙肝肝硬化及原发性肝癌发病的分子机理及寻找更好的治疗手段奠定基础。并将为阐明从慢乙肝发展到肝病终末期的分子发病机理奠定基础。 我们分别从1例慢乙肝患者、1例乙肝肝硬化患者及l例原发性肝癌患者的肝组织中提取了总RNA，构建了3个中国人的慢性肝病组织cDNA文库，这将为探讨从慢乙肝发病到进展为肝病末期的分子发病机理及寻找更好的治疗手段奠定基础。 材料与方法: 用Trizol方法提取人慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及原发性肝癌组织总RNA并用mRNA纯化试剂盒进行mRNA纯化;反转录合成单链cDNA，长距离PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K水解、纯化后，用Sfil酶切;将酶切产物进行分级分离，回收0.4kb以上的cDNA组分，并与入TripExZ载体连接;连接产物经体外蛋白包装，产生未扩增文库;鉴定文库的滴度和重组效率后，进行文库扩增;鉴定扩增文库的滴度和重组效率;分别随机挑取14个、11个及14个噬菌斑，用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增，以检测所构建的cDNA文库的质量。 结果: 慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及原发性肝癌未扩增文库的滴度测定分别为x.94xlo6p创m一、l.o3xlo6p创ml及l.37xlo6p细ml，重组克隆百分比分别为98.15%、97.24%及97.46%。扩增后文库的滴度测定分别为1.49xl09p细ml、1.36Xlogp创ml及l.Zsxlogp创mx，重组克隆百分比分别为95.760，0、99.020，0及99.06%。 慢性乙型肝炎文库cDNA插入片段的平均长度为1 .23 kb，9个1 kb一Zkb，5个0.5 kb一1，0 kb。乙型肝炎肝硬化文库cDNA插入片段的平均长度为1 .02kb，4个1 kb一2 kb，7个0.skb一Ikb。原发性肝癌文库cDNA插入片段的平均长度为0 .96 kb，4个1 .0 kb一2.0 kb，10个0，5 kb一1 .0 kb。 结论:成功构建了3个中国人的慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及原发性肝癌患者组织cDNA文库。