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背景 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染导致的慢性乙型肝炎是严重威胁人类健康的重要传染病。有效地抗病毒治疗,对于延缓或阻断慢乙肝患者的疾病进程具有重要意义。干扰素类(普通干扰素和聚乙二醇化干扰素)和核苷(酸)类似物(拉米夫定、替比夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替诺福韦等)是临床慢乙肝抗病毒治疗的一线药物。然而,长期用药所带来的干扰素抵抗和核苷(酸)类似物耐药等问题,严重影响抗病毒疗效。因此,迫切需要寻找更加有效的新型抗病毒生物制剂。现已明确,机体免疫系统的多种细胞因子(IFN、IL-12、IL-15、IL-29、IL-27及IL-32γ等)均具有不同程度地抗HBV活性。其中,与IL-12、IL-27同属于IL-12家族的IL-35是新发现的细胞因子,由IL-27β链EBI3和IL-12α链P35两个异源亚基组成。据报道,在多种自身免疫性疾病动物模型(免疫相关性血细胞减少症、原发性干燥综合征、Beh?et病、溃疡性结肠炎及克罗恩病等),发现IL-35能够减轻体内炎症程度进而显著缓解疾病症状,提示IL-35具有治疗自身免疫性疾病的临床应用价值。最新研究发现,在感染宿主的非免疫细胞中,IL-35能通过促进细胞分泌干扰素继而发挥广谱的抗病毒活性,包括甲型流感病毒、人肠道病毒71、水疱性口炎病毒等。我们前期研究发现,无论是瞬时转染HBV全基因组的HepG2和LO2细胞,还是稳定转染HBV基因组的PLC/PRF/5细胞,IL-35均能抑制HBV复制和抗原分泌,提示IL-35可能具有潜在抗HBV活性。目的 通过临床与体外实验研究,探讨HBV感染与IL-35表达可能存在的关系,并阐明IL-35在抗病毒治疗的作用,从而揭示IL-35影响病毒复制及IFN-α抗病毒活性的机理,以期为今后研发新型抗HBV生物制剂提供新的线索。方法 以169例未治疗的慢性HBV感染患者和54例健康人群为研究对象,运用ELISA技术分析血清IL-35含量,免疫组化技术分析肝组织中IL-35表达水平与分布情况;随访36例接受48周Peg-IFN-α抗病毒治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者,动态监测患者血清IL-2、IFN-γ、TNF-β、IL-5、IL-10、IL-6和IL-35含量;依据抗病毒疗效,将患者分为持续性应答和不应答患者,分析不同疗效患者血清IL-35含量的基线水平和动态变化特征。以HepG2、HepG2.2.15、Huh7、LO2和PLC/PRF/5细胞为模型,通过转染HBV全基因质粒pHBV1.3或HBV编码蛋白表达质粒(pEGFP-HBs、pEGFP-HBc、pEGFP-HBx和pEGFP-HBp)至肝细胞,实时荧光定量PCR和ELISA技术分析IL-35 mRNA和蛋白含量;通过启动子报告质粒pGL3-EBI3-promoter和pGL3-p35-promoter与HBV编码蛋白表达质粒共转染细胞,再以NF-κB抑制剂SN50处理,光度计测定细胞荧光素酶活性;采用不同浓度IL-35或与IFN-α联合处理转染HBV基因的肝细胞,分析细胞内HBV-DNA、上清液HBV抗原含量;共转染pcDNA3.1/EBI3或pcDNA3.1/P35与HBV全基因质粒,分析细胞内病毒复制水平;IL-35处理肝细胞后,Western-blotting和细胞免疫荧光技术等分析IFN-α-JAK-STAT信号通路分子表达、干扰素应答元件ISRE活性;共转染pGL3-IL-6-promoter与HBV全基因质粒至肝细胞,IL-35处理后分析细胞荧光素酶活性;以siRNA干扰(转染siRNA-STAT1、siRNA-STAT2和siRNA-IRF-9)肝细胞JAK-STAT信号通路分子,IFN-α处理后分析上清液IL-6含量;IL-6单独处理或与IFN-α联合处理细胞,Western-blotting检测细胞内SOCS3蛋白表达,并进一步分析其对细胞抗病毒蛋白表达及HBV复制的影响;最后,以IL-35处理转染病毒质粒的肝细胞,整体分析IL-35可能存在的抗病毒机理。结果 临床研究发现,在慢性HBV感染患者血清和肝组织IL-35含量较健康人群显著升高,尤其是HBeAg阴性慢性HBV感染患者。除肝细胞外,患者肝组织炎症细胞也表达IL-35;IFN-α治疗过程中,患者血清IL-2、TNF-β和IL-6分别在治疗48周、12周和12周降低最为明显,而IL-35、IFN-γ和IL-10则分别在12周、24周和36周升高最为显著。持续性应答组患者较不应答组患者的血清IL-35含量在基线水平高,同时在治疗12周时上升也更为明显。基线和治疗12周的IL-35含量预测HBeAg阳性慢乙肝患者抗病毒疗效的曲线下面积分别为0.74和0.85。体外细胞实验研究发现,IL-35两个异源亚基EBI3和P35在HBV全基因稳转的HepG2.2.15细胞中含量显著较HepG2细胞升高,并且瞬时转染pHBV1.3至HepG2、Huh7和LO2细胞后,细胞EBI3和P35的mRNA和蛋白含量也均上升;HBx通过NF-κB增强EBI3和P35启动子活性进而能诱导上述肝细胞分泌IL-35。IL-35在体外能抑制HepG2、LO2细胞HBV复制和PLC/PRF/5细胞分泌HBsAg;IL-35与IFN-α联合处理HepG2和LO2细胞后,显著提高IFN-α抗HBV活性。IL-35对HepG2、LO2和PLC/PRF/5细胞内JAK-STAT分子表达及干扰素刺激应答元件ISRE活性无显著影响,却能通过下调IL-6启动子活性继而减少肝细胞分泌IL-6,从而发挥抑制HBV复制的作用。IFN-α呈时间和浓度依赖性诱导HepG2和LO2细胞IL-6表达,而加入外源性IL-6能抑制IFN-α抗HBV效应。转染siRNA-IRF-9显著抑制IFN-α诱导肝细胞IL-6上调表达,而转染pcDNA3.1/IRF-9促进IFN-α诱导效应。IL-6或IFN-α诱导肝细胞表达SOCS3;而IL-35处理转染HBV全基因组的HepG2和LO2细胞,能下调细胞分泌IL-6和SOCS3和上调抗病毒蛋白MxA,OAS和PKR的表达。结论 (1)HBV感染导致慢性HBV感染患者体内IL-35含量升高;(2)高水平IL-35有利于IFN-α抗病毒疗效;(3)HBV通过HBx/NF-κB信号通路增强IL-35亚基启动子活性进而诱导肝细胞分泌IL-35;(4)HBV和IFN-α均能诱导肝细胞分泌IL-6,其中JAK-STAT信号通路重要分子IRF-9介导IFN-α诱导效应;(5)IL-35通过抑制IL-6/SOCS3信号通路继而发挥直接抗病毒活性和与IFN-α协同抗病毒效应。