论文部分内容阅读
研究背景：抑郁症是一种以显著而持久的情绪低落为主要临床特征的情感障碍性疾病。据世界卫生组织估计,到2020年抑郁症将成为人类第二大致残性疾病。目前,抑郁症的病因及发病机制仍不清楚,虽然关于抑郁症的病因提出了许多假说,但尚无公认的假说能令人信服地解释抑郁症的发病机制。大量研究结果表明,细胞因子在抑郁症的发生、发展过程中扮演重要角色。海马是大脑边缘系统的重要组成部分,是情感、学习、记忆等多种高级神经活动的重要结构基础。大量影像学及尸检研究显示抑郁症患者及抑郁症动物模型均有海马体积减小、神经元数量减少和海马神经元树突结构的改变。细胞骨架是大脑海马神经元结构和功能的基础,微管、微丝是神经元细胞骨架的主要成分,由于微管和微丝具有极性结构和动态不稳定性,能在细胞内外不同刺激作用下发生快速聚合/解聚,通过聚合和解聚状态的转换维持细胞骨架的结构和功能。微管是细胞骨架的架构主干,除了红细胞外,所有的细胞微管均由分子量约55kD的α及β微管蛋白组成。正常时微管蛋白以异二聚体的形式存在,并以首尾相连的方式聚合形成微管蛋白原纤维。微丝也是真核细胞中普遍存在的实心状纤维,主要以单体(G-actin)和纤维状(F-actin)两种形式存在,具有收缩、支持、非肌性运动和信息传导等多种功能。细胞因子是免疫活性细胞分泌的具有调节免疫应答的生物活性信号分子,根据细胞因子在炎症反应中的不同作用分为炎性细胞因子和抗炎性细胞因子。炎性细胞因子主要参与炎症的反应过程,如：IL-1,IL-6,IFN-Y和TNF-α,而抗炎性细胞因子通过抑制细胞的活化和炎性调节子的产生抑制免疫应答起到抗炎作用,如：IL-4,IL-10,IL-13等细胞因子。外周细胞因子主要通过免疫激活产生,当机体受到躯体应激、心理应激和免疫干预等多种作用时,机体的免疫系统即被激活,单核-巨噬细胞系统活性增加,使IL-1、IL-6及TNF-α等前炎症细胞因子水平升高。研究发现,在中枢神经系统中也存在各种细胞因子。星形胶质细胞和小胶质细胞在各种应激和损伤刺激作用下能产生IL-1,IL-6,TNF-α和IFN-γ等多种细胞因子,引起机体一系列生理生化改变。大量的遗传、动物行为及临床等方面的研究表明,血清TNF-α和IL-1等前炎症细胞因子的含量变化与增加抑郁、认知受损的风险和降低抑郁的治疗效果有密切关系。临床观察研究发现多发性硬化、风湿性关节炎、过敏性疾病等慢性非感染性免疫性疾病常伴发抑郁症状。抑郁症患者血浆中IL-1β、IL-6和IFN-γ水平增加,而且患者脑脊液中IL-1β的增加与抑郁的严重程度相关。动物研究发现,脂多糖(LPS)能有效刺激IL-1、IL-6、TNF-α等前炎症细胞因子的产生和分泌。在LPS免疫激活模型中,LPS的刺激可以使实验大鼠活动减少、食欲减退、探索周围环境的兴趣下降、性驱力减弱、体温升高,抗抑郁治疗能有效抑制LPS诱导的大鼠快感缺失。总之,细胞因子不仅促进许多躯体疾病的发生、发展,而且可能是抑郁症本身的病理生理基础。有关细胞因子与抑郁症的关系的动物实验和临床研究已明确显示细胞因子在抑郁症的发生、发展中具有重要作用,然而,细胞因子是如何导致抑郁样行为,其发生的分子机制是什么?细胞因子是否通过影响海马神经元细胞骨架,使海马结构、功能发生异常改变,导致抑郁症状的产生?其信号转导机制是什么?目前关于细胞因子对海马神经元细胞骨架的影响及其信号转导机制的相关性研究还很少,因此,为了明确前炎症细胞因子与海马神经元的关系,本研究应用IL-1β处理体外培养的大鼠海马神经元以探索IL-1β对海马神经元细胞骨架微管及微丝蛋白的影响与神经元形态学改变的关系,对我们认识抑郁症的发病机制及发现新的抑郁症治疗靶点具有重要意义。目的：通过IL-1β或IL-1ra处理海马神经元,探讨IL-1β对海马神经元存活率的影响以及IL-1β对海马神经元的形态和细胞骨架蛋白α-tubulin、F-actin表达的影响。方法：(1)原代海马神经元培养、纯化及鉴定；(2)实验分组：(i)对照组：空白对照+生理盐水；(ii)0.01ng/ml实验组：IL-1β处理浓度为0.01ng/ml：(iii)0.1ng/ml实验组：IL-1β处理浓度为0.1ng/ml;(iv) lng/ml实验组：IL-1β处理浓度为lng/ml;(v)10ng/ml实验组：IL-1β处理浓度为10ng/ml;(vi)20ng/ml实验组：IL-1β处理浓度为20ng/ml;(vii)50ng/ml实验组：IL-1β处理浓度为50ng/ml;(viii)100ng/ml实验组：IL-1β处理浓度为100ng/ml.(3)海马神经元活性检测。(4)应用细胞免疫化学检测IL-1β对海马神经元形态结构的影响。(5)应用细胞免疫荧光染色检测IL-1β对海马神经元细胞骨架α-tubulin、F-actin的分布及排列。(6)应用蛋白免疫印迹法检测IL-1β对海马神经元细胞骨架α-tubulin、F-actin表达的变化。结果：(1)IL-1β在浓度为0.01,0.1和1ng/ml时促进神经元发育、生长,在0.1ng/ml时促进作用最明显,表现为神经元树突伸长、分支增加,棘突明显增多；随IL-1β的浓度不断升高,对海马神经元逐渐产生抑制作用,表现为棘突数目减少,分支减少、缩短,树突萎缩,甚至树突断裂,棘突消失,神经元死亡。当IL-1β处理浓度在0.01,0.1和1ng/ml时一、二、三级突起增加,神经元一级突起数与对照组比较无统计学差异(P>0.05),二级及三级突起改变与对照组存在显著差异(P<0.01)；当浓度在10至100ng/ml时随浓度的升高一级突起数减少,IL-1β浓度在20,50,100ng/ml时与对照组比较存在统计学差异(P<0.05),二级、三级突起改变与对照组比较有显著差异(P<0.01)。IL-1ra有抑制IL-1β的作用。(2)IL-1β浓度在0.01,0.1和lng/ml时,对海马神经元的活性有明显促进作用,在0.1ng/ml时IL-1β对海马神经元活性的促进作用最高(P<0.01),随着IL-1β的作用浓度不断增加,IL-1β对海马神经元活性逐渐产生抑制作用(P<0.01)。(3)培养上清液中IL-6的含量随IL-1β处理浓度的不断升高,呈逐渐上升趋势,当IL-1β处理浓度在20,50及100ng/ml时IL-6的含量与对照组比较有统计学差异(P<0.05)；而培养上清液中TNF-α的含量随IL-1β处理浓度的升高,呈明显上升趋势,在IL1-β处理浓度在10,20,50及100ng/ml时TNF-α的含量与对照组比较有显著统计学差异(P<0.01)。低浓度的IL-1β能使神经元BDNF分泌明显增加,与对照组比较有显著的统计学差异(P<0.01),而当处理浓度逐渐升高后,BDNF分泌迅速降低,与对照组比较有显著统计学差异(P<0.01)。(4)IL-1β对海马神经元α-tubulin及F-actin分布的影响细胞免疫荧光染色结果显示,0.01,0.1,lng/ml IL-1β处理后,神经元各级突起数量较对照组增加,以0.1ng/ml处理浓度增加最明显,神经元的一级突起增加不明显,而二级、三级突起均有明显增加、延长；IL-1β的处理浓度增加到10,20,50ng/ml时海马神经元突起开始减少,二级、三级突起变得短小,甚至消失。低浓度IL-1β使海马神经元细胞骨架蛋白a-tubulin、F-actin在整个胞体、突起分布增加,a-tubulin在突起中的分布随突起的延伸呈梯度减少,F-actin的分布以突起的末端增加更显著；高浓度IL-1β使a-tubulin和F-actin在海马神经元内分布呈剂量依赖性减少,以突起远端更显著。(5)IL-1β对海马神经元细胞骨架蛋白a-tubulin及F-actin表达的实验结果显示,在处理浓度为0.0lng/ml时α-tubulin及F-actin表达较对照组高,0.1ng/ml较0.01ng/ml的蛋白表达水平更高,而IL-1β在0.1ng/ml时细胞骨架蛋白的表达与对照组比较有显著统计学差异(P<0.01),浓度在lng/ml时细胞骨架蛋白的表达与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。随着IL-1β浓度的升高,细胞骨架蛋白的表达较对照组下降,20、50、100ng/ml处理组与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。结论：低浓度的IL-1β促进海马神经元的存活率和突起的生长、发育,增加IL-6、TNF-α、 BDNF的分泌,使细胞骨架蛋白α-tubulin及F-actin的表达增加；高浓度IL-1β有抑制海马神经元的存活率和突起的生长、发育,增加IL-6、TNF-α和抑制BDNF分泌的作用,使细胞骨架蛋白α-tubulin及F-actin的表达减少。