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松树萎蔫病(Pine wilt disease,PWD)是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起,主要对我国松属植物危害巨大,造成了不可估量的林业资源损失。在化学药剂渐渐被淘汰,生物药剂也不能完全根治松树萎蔫病的背景下,基因工程下的转基因抗病植物研究将变得越来越热门。淡紫拟青霉(Purpureocillium lilacinum)在防治植物线虫上效果显著,通过产生几丁质酶和丝氨酸蛋白酶作为重要的毒力因子来防治线虫。本试验通过淡紫拟青霉E22对松材线虫进行试验,针对淡紫拟青霉E22进行无参转录组分析,在差异基因筛选、GO富集分析和KEGG中pathway富集分析来挖掘对松材线虫有毒力作用的几丁质酶基因家族和丝氨酸蛋白酶基因家族,并利用生物信息学对所有基因进行分析,为后续转基因抗病松属植物的研究铺垫道路。1.通过转录组测序,获得有效数据共73.91Gb,组装的转录本序列共167,018条,经过组装的非冗余单基因共有107,830个,分别比对到Nr,Nt,Pfam,KOG,Swiss-prot,KEGG,GO七个公共数据库上。得到差异基因51,067个,其中49,265个基因上调,1,802个基因下调。2.通过对差异基因表达量提升6倍并通过Pfam数据库注释进行筛选,得到了 8个GH19 家族几丁质酶Ⅰ类基因,它们分别是Cluster-7269.0、Cluster-11977.0、Cluster-34695.5883、Cluster-16977.0、Cluster-19046.0、Cluster-31483.0、Cluster-12366.0、Cluster-34695.18565。7个丝氨酸蛋白酶S10家族基因,它们分别是Cluster-45122.0、Cluster-34695.26144、Cluster-39710.0、Cluster-42428.0、Cluster-21153.0、Cluster-38672.0、Clus ter-7477.0。3.在GO富集分析中,8个GH19家族几丁质酶Ⅰ类基因都参与了三个过程,分别是大分子分解过程、细胞分解过程和分解代谢过程,这与分解松材线虫体壁和细胞有关。7个丝氨酸蛋白酶S10家族基因都参与了三个过程,分别是蛋白质代谢过程、蛋白质分解过程和肽酶活性,这与分解松材线虫体内蛋白质有关。由于KEGG注释基因数量有限,只富集了核糖体代谢通路和胞吞作用代谢通路,这两条重要的代谢通路为应对松材线虫胁迫发挥了重要的作用。4.对8个GH19家族几丁质酶Ⅰ类基因进行生物信息学分析,它们开放阅读框(ORF)、氨基酸长度以及蛋白分子量大体一致,等电点十分接近,都是稳定的亲水性蛋白,亚细胞定位显示为胞外或膜结合胞外蛋白;8个几丁质酶在系统发育进化树上总体为100,进化关系高度一致,都只有一个外显子;通过对8个几丁质酶的氨基酸多序列比对发现有多个保守结合位点组成保守结构域,保守基序也是高度相似;通过二级和三级结构预测分析8个几丁质酶是富含α-螺旋的保守结构域,这为其破坏松材线虫体壁大分子奠定了基础。5.对7个丝氨酸蛋白酶S10家族基因进行生物信息学分析,开放阅读框(ORF)、氨基酸长度以及蛋白分子量基本一致,都是亲水性蛋白,大部分都是稳定蛋白,亚细胞定位显示大部分为胞外或者膜结合胞外蛋白;系统发育进化树显示7个丝氨酸蛋白酶总体为99,都只有一个外显子;在氨基酸多序列比对中,有很多保守结合位点一起组成保守结构域,保守基序完全一致,说明进化过程高度统一;通过二级和三级结构预测分析7个丝氨酸蛋白酶主要是以α-螺旋和无规则卷曲组合的保守结构域来发挥裂解松材线虫蛋白质肽键的功能。