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暗发酵制氢具有不需要光照、反应器要求简单、产氢速率较快和能够利用有机废弃物进行氢气生产等优点,以及广阔的产业化前景。但是,产氢得率低、发酵底物成本高等问题限制了暗发酵制氢技术的产业化应用。因此,本论文以实验室自行筛选的一株兼性厌氧菌——K.pneumoniae ECU-15菌株为研究对象,采用Plackett-Burman设计实验、Box-Behnken实验和响应面分析法等优化方法对该菌株的产氢培养基进行了优化,确定了培养基中关键组分及其最佳组成,随后研究了发酵温度和pH对菌体生长、氢气生成和氢酶表达活性的影响。采用Plackett-Burman实验设计、Box-Behnken实验和响应面分析法对K.pneumoniae ECU-15菌株最优产氢的培养基成分及其组成进行了优化,并得到了最优产氢培养基组分：葡萄糖35.62g/L；酵母粉9.0g/L；硫酸铵2.78g/L；磷酸盐缓冲液200.0mM；微量元素23.15ml/L；L-cys1.0g/L。初始pH为6.0-6.2,培养温度为37℃的条件下,培养基优化后该菌株的产氢量为4061.1ml/L较优化前的2114.3ml/L增加了92%。恒定的发酵pH更有利于K.pneumoniae ECU-15菌株产氢,当pH控制在6.0-6.2时,该菌株的产氢量为5363.8ml/L比不控制过程pH时的4061.1ml/L增加了32%。发酵温度和发酵pH对菌体生长、氢气合成以及氢酶的表达活性有着显著的影响。实验的温度范围内(30-40℃),最大菌体量和产氢量随发酵温度的上升呈现先上升后下降的趋势,在37℃时得到最高菌体量5.48g/L和最大产氢量5363.8ml/L。产氢酶和吸氢酶的表达活性与发酵温度正相关,二者均在40℃时表现出最高的表达活性,分别为995.7U/(g DCW)和1042.1U/(g DCW)。在研究的pH范围内(5.0-8.0),最大菌体量随着发酵pH的上升而增加,pH为8.0时取得最大值5.86g/L。最大产氢量随pH的升高呈现先上升后下降的趋势,在pH为6.0时得到最大产氢量5363.8ml/L,从而可知pH为6.0时最适合氢气的生成,pH为8.0时最适合菌体的生长。pH对氢酶活性有较大影响,产氢酶表达活性随着pH的升高而降低,该数值从pH为5.0时的1081.4U/(g DCW)降为pH为8.0时的250U/(g DCW);吸氢酶的表达活性随着发酵pH的升高而升高,该数值从pH为5.0时的905.4U/(g DCW)增加为pH为8.0时的1041.2U/(g DCW)。