论文部分内容阅读
结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,结肠癌的治疗方法主要有手术切除结合化疗和放疗。化疗毒副作用严重,且癌细胞对化疗药物容易产生耐药性,导致化疗效果有限。寻找新的抗肿瘤治疗药物非常有必要。多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗衰老等多种生物活性。若干多糖可通过直接抑制肿瘤细胞增殖或增强机体的免疫能力间接抑制肿瘤生长,是潜在的肿瘤预防和治疗药物。黑根霉(Rhizopus nigricans)是一种接合菌门丝状真菌,本课题组从黑根霉发酵液中分离纯化出一种分子量为9,682 Da的多糖(EPS1-1),已有结果表明该多糖能够增强免疫抑制小鼠的免疫功能,诱导HCT-116细胞的凋亡,抑制S180和CT26移植瘤小鼠肿瘤的生长与转移,并抑制氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)诱导的小鼠结肠癌的发生与发展。然而,EPS1-1抗结肠癌作用的分子机制尚不清楚。本文首次利用细胞培养、小鼠结肠癌诱导模型和CT26细胞肺转移模型,研究了 EPS1-1直接抑制结肠癌的机制。并研究了 EPS1-1对肠道免疫功能及巨噬细胞的作用,揭示其通过免疫途径抑制肿瘤的机制。1.EPS1-1对CT26细胞、小鼠结肠癌组织和CT26细胞肺转移组织内基因表达的影响EPS1-1可抑制CT26细胞的增殖和集落形成,诱导CT26细胞的凋亡。利用转录组测序比较了 EPS1-1处理CT26细胞前后基因表达的变化,结果发现处理细胞4 h和24 h后分别引起98个和988个基因出现差异表达。差异基因参与了多条与肿瘤发生相关的信号转导途径,如PI3K-Akt、Rap1、TNF、Ras、MAPK等信号转导通路。在上述处理时间,别有10个和43个差异表达基因被注释到PI3K/Akt-mTOR信号转导通路。建立AOM/DSS诱导的小鼠结肠癌模型,发现小鼠饮用EPS1-1(150mg/kg/d)明显抑制了小鼠结肠癌的发生发展。利用转录组测序进一步研究EPS1-1抑制小鼠结肠癌发展的可能的作用机制,结果表明EPS1-1可引起结肠癌肿瘤组织内6170个基因出现差异表达。这些差异表达基因主要参与了代谢过程、信号传导、细胞生长、对刺激的反应等,同时也参与了多条与肿瘤相关的信号转导途径,其中217个差异表达基因与PI3K/Akt-mTOR信号转导通路有关。推测该信号转导通路和与EPS1-1抑制结肠癌的发生发展密切相关。Western-blot进一步分析了 EPS1-1对CT26细胞及结肠癌组织内PI3K/Akt-mTOR信号转导通路的影响。结果表明EPS1-1处理CT26细胞4 h即可显著抑制PTEN和Akt的磷酸化水平。处理24 h后显著下调了 p-PTEN和p-mTOR的表达。免疫组织化学染色结果表明EPS1-1可降低小鼠结肠内p-PTEN、p-Akt、p-PI3K、p-mTOR 及 p-p70S6K 的阳性表达。Western-blot 分析结果进一步表明EPS1-1显著抑制了小鼠结肠癌组织内PTEN、mTOR及p70S6K的磷酸化。选取CT26细胞肺转移小鼠肺组织表面肿瘤组织进行转录组测序,结果表明EPS1-1可调节肿瘤组织中2630个基因出现显著变化,有2106个基因发生上调,524个基因发生下调。这些差异表达基因主要参与290条生物通路,主要包括信号转导、信号分子与互作、细胞运动、运输与代谢等。其中黏着斑(Focal adhesion)和细胞粘附分子(Cell adhesion molecules,CAMs)属于细胞运动和信号分子互作,与肿瘤转移相关,分别有74个和73个差异表达基因被注释到这两个生物通路中。信号转导中的多条途径与肿瘤侵袭、转移相关,如PI3K-Akt、cGMP-PKG、mTOR、钙离子等信号转导途径。其中PI3K/Akt-mTOR信号转导通路与104个差异表达基因有关,且有45个差异表达基因属于该途径和黏着斑、细胞粘附分子的共表达基因。这些基因主要包括整合蛋白、锚蛋白、E-钙粘着蛋白等,与肿瘤迁移和转移相关。以上结果表明,EPS1-1抑制肿瘤生长和转移与PI3K/Akt-mTOR信号转导途径的抑制有关。2.EPS1-1对结肠癌小鼠肠道免疫功能的增强作用一些功能多糖在上消化道不能被分解,进入肠道后可促进肠道益生菌的增殖,刺激肠道免疫细胞的功能,提高宿主机体免疫功能。采用16SrRNA扩增子测序技术检测了 EPS1-1对AOM/DSS诱导的结肠癌小鼠肠道内微生物菌群结构的影响,结果表明在结肠癌模型组科水平的致病菌群Ruminococcaceae和Helicobacter的相对丰度增加。EPS1-1可降低以上两种致病菌的丰富,同时增加分泌SCFAs的益生菌Lachnospiraceae、Roseburia及Coprococcus丰度。用HPLC检测小鼠肠道内SCFAs及乳酸含量,结果表明EPS1-1处理结肠癌小鼠后可引起肠道内SCFAs含量的增加,其中乙酸和丙酸含量增加显著。乳酸含量在EPS1-1处理组肠道内也显著增加。EPS1-1还可增加结肠癌小鼠肠道内绒毛长度和绒毛长度与隐窝深度(Villus length/crypt depth,V/C)的比值,降低了致癌剂对肠道的损伤。EPS1-1可维持结肠癌小鼠肠道内不同类型黏液分泌细胞的比例,保护肠道黏膜层的功能及完整性,促进了肠道免疫功能。这些结果表明EPS1-1可进入肠道增加肠道益生菌的丰度,促进肠道菌群分泌有益物质,维持肠道结构的完整性,调整肠道黏液分泌细胞的结构,从而促进肠道免疫功能,抑制结肠癌的发生与发展。3.EPS1-1对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节及其作用机制巨噬细胞的激活可促进细胞因子和NO的释放,提高机体的免疫能力,从而发挥抗病毒和抗肿瘤作用。EPS1-1可促进小鼠腹腔巨噬细胞的成熟,显著增强其吞噬活性。实时定量结果表明,EPS1-1可显著上调巨噬细胞内iNOS、IL-2及TNF-α的mRNA水平。为了阐明EPS1-1激活小鼠腹腔巨噬细胞的作用机制,我们采用Western blot检测了巨噬细胞内MAPK和NF-κB信号途径关键蛋白的表达。结果显示EPS1-1显著性上调了巨噬细胞表面受体TLR4的表达量,增加MAPK信号途径关键蛋白p38 MAPK、Erk和JNK蛋白的磷酸化。EPS1-1可上调NF-κB信号途径中关键蛋白p-IKKα/β蛋白的表达。MAPK信号转导通路抑制剂(PD98059和SB203580)抑制了小鼠腹腔巨噬细胞内iNOS、IL-2及TNF-α的mRNA水平,及信号通路中关键蛋白TLR4、p-p38MAPK、p-Erk1/2蛋白的表达,而EPS1-1处理可恢复抑制剂对这些基因及蛋白表达的的抑制作用。在不同刺激因素下,细胞内MAPK和NF-κB信号途径之间存在着复杂的相互作用。抑制剂处理巨噬细胞后可抑制IκB和p-IKKα/β蛋白的表达,表明p38MAPK、Erk1/2与IκB存在着交互作用。这些结果表明,EPS1-1可通过MAPK信号途径促进小鼠腹腔巨噬细胞的免疫功能,并且MAPK和NF-κB信号途径在激活小鼠腹腔巨噬细胞中存在相互作用,共同调节iNOS、IL-2及TNF-α的表达。综上所述,EPS1-1可以通过下调PI3K/Akt-mTOR信号转导途经直接抑制肿瘤的生长和转移。该多糖还可通过调节结肠癌小鼠肠道内微生物菌群的结构,促进肠道免疫,并激活小鼠腹腔巨噬细胞通过免疫途径抑制结肠癌的发生。本研究对揭示多糖的抗肿瘤机理有重要意义,为黑根霉胞外多糖的进一步开发提供了基础数据支持。