前言Livin是近年来发现的人类凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis family of protein,IAP)家族的新成员,在多数肿瘤组织中高表达,如黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、白血病以及淋巴瘤等。我们的前期研究表明,Livin在人正常组织中不表达,在骨肉瘤组织中表达;有研究表明肺癌的患者并且经过化学治疗的患者Livin表达水平明显升高,表明在化疗药物诱导癌细胞凋亡的同时,癌细胞合成表达抗凋亡的因子(如Livin)引起凋亡耐受,这可能是临床上肿瘤发生耐药的机制之一。进一步的体外实验证明,在黑色素瘤、淋巴瘤细胞、肺癌等中Livin的过表达与化疗耐药有关。因此,Livin可能在肿瘤化疗耐药过程中发挥作用。Livin基因在抗凋亡作用中的生物学功能及在抗骨肉瘤细胞凋亡作用中的具体机制,以及其是否参与骨肉瘤细胞化疗耐药等还不清楚。我们构建了Livin真核表达载体,基因转染并获得高表达Livin基因的骨肉瘤U-2OS细胞,以探讨Livin基因对U-2OS细胞生长及化疗敏感性及凋亡耐受性的影响。骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤,恶性度高,预后差。其发生发展的过程尚不清楚,临床上也缺乏特异性的病理诊断指标。Livin是近年来发现的人类凋亡抑制蛋白家族的新成员,已发现在多数肿瘤中表达,与肿瘤发生有密切关系,可能作为诱导肿瘤凋亡治疗的新靶点。Caspase-3被认为是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶。然而,尚未见有关骨肉瘤患者Livin表达情况以及其与Caspase-3表达的关系,与骨肉瘤发生、发展、生物学特性及临床诊断价值的报道。本研究采用SABC免疫组化方法检测Livin和Caspase-3在骨肉瘤组织中的表达,探讨两者与骨肉瘤发生的关系及其临床诊断价值。骨肉瘤是人类常见的原发性间叶组织恶性骨肿瘤,常发生于青少年,传统截肢疗法预后差,5年生存率不到20%。目前虽在术前术后给予化疗后生存率有所提高,但对于化疗耐受和转移复发的病例,化疗或手术常难以奏效。因此,应当在肿瘤的生物治疗方面深入研究,以探索有效的辅助治疗方法,提高骨肉瘤的治愈率。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是近年来发展起来的新技术,它主要利用双链RNA(double-stranded RNA)在细胞内经Dicer酶的识别、结合、酶切产生有活性的长度为21～23 nt小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),与目的基因mRNA结合并使之降解,从而抑制目的基因的表达。RNAi的发现为基因治疗学提供了更为有效的方法。Livin基因作为细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的新成员,由于其具有在正常组织中不表达,而在人类肿瘤中高表达的特性,有望成为肿瘤治疗的选择性靶点,近年来引起学者们的广泛关注。我们的前期研究表明,Livin在人正常组织中不表达,在骨肉瘤组织中高表达,提示其在骨肉瘤的发生、发展中起重要作用。本研究通过RNAi技术靶向抑制人骨肉瘤MG-63细胞Livin基因表达,探讨利用体外转录的siRNA的方法诱导骨肉瘤细胞凋亡,从而为骨肉瘤的基因治疗提供新策略。目的第一部分:探讨Livin和Caspase-3的表达在骨肉瘤发生中的可能作用及其临床意义。第二部分:研究转染Livin基因对人骨肉瘤U-2OS细胞生长及化疗敏感性的影响。第三部分:体外转录合成凋亡抑制蛋白Livin基因siRNA,通过RNAi技术靶向抑制人骨肉瘤MG-63细胞Livin基因表达,观察其在骨肉瘤细胞株MG-63中抑制Livin表达后细胞增殖及细胞凋亡情况,从而为骨肉瘤的基因治疗提供新策略。方法第一部分:用SABC免疫组化方法检测Livin和Caspase-3在45例骨肉瘤及30例骨软骨瘤中的表达,探讨骨肉瘤组织中Livin和Caspase-3表达的关系及与临床病理因素的联系。第二部分:基因转染获得稳定表达Livin的U-2OS细胞克隆,逆转录-聚合酶链反应、Western blot及免疫荧光化学法了解Livin在转染细胞中基因水平和蛋白水平的表达情况;用平板克隆形成实验研究细胞生长情况;甲基偶氮唑蓝法研究细胞对化疗的敏感性的影响。第三部分:体外转录合成Livin序列特异性双链RNA(dsRNA),转染MG-63细胞株中,用荧光显微镜观察转染前后细胞形态的改变,RT-PCR和Western blot法检测转染前后Livin基因的mRNA和蛋白的干涉效果,流式细胞仪检测siRNA转染效率和细胞凋亡,平板克隆形成实验计算克隆形成率,MTT法检测细胞增殖,吖啶橙荧光染色法检测细胞凋亡,观察MG-63细胞生物学特性的改变。结果第一部分:Livin在骨肉瘤中表达阳性率为62.2%,在骨软骨瘤中为3.3%,二者相比差异有显著意义(P=0.000)。Caspase-3在骨肉瘤中表达阳性率为35.6%,在骨软骨瘤中为83.3%,二者相比差异有显著意义(P=0.001)。骨肉瘤中Livin和Caspase-3的表达呈显著负相关(r=—0.666,P=0.000)。Livin的高表达与骨肉瘤组织分型无关,与Price病理分级有关,Caspase-3的低表达与分化程度有关。第二部分:与转染前比较,Livin基因转染后,表达Livin的人骨肉瘤U-2OS细胞克隆形成能力提高约30%、细胞生长速度增快、倍增时间缩短9.2 h(P＜0.05),对多种化疗药物,转染Livin基因的U-2OS细胞对化疗药物敏感性降低(P＜0.01)。第三部分:转染特异性siRNA的细胞其Livin mRNA及蛋白表达均下调,与其它两组相比显著降低,(P＜0.05);干涉后部分细胞变圆,折光性降低,死亡细胞增多,细胞的增殖受到抑制,细胞集落形成明显减少,细胞凋亡增多,Western blot检测Caspase-3蛋白表达增多与其它两组比较有显著性差异(P＜0.05)。结论第一部分:Livin在骨肉瘤组织中高表达,Livin和Caspase-3与骨肉瘤的发生有关,且具有相关性,联合检测Livin和Caspase-3的表达将对骨肉瘤的早期诊断,判定恶性程度及预后具有指导意义。以Livin与Caspase-3为靶点,所进行的诱导骨肉瘤细胞凋亡的治疗,可望成为人骨肉瘤靶向凋亡诱导治疗的良好策略,将作为目前常规化疗的重要补充,在临床康复治疗中发挥出巨大的抗肿瘤效果。第二部分:由于肿瘤细胞内Livin的过表达,导致了肿瘤细胞对化学药物耐受,这些是临床上采用细胞因子和化学药物治疗肿瘤时要面临的肿瘤耐药问题。Livin参与骨肉瘤的发生发展,是骨肉瘤细胞对化疗耐受的重要机制之一,如果能找到一种药物可以降低Livin的表达,就可以抑制肿瘤细胞的增殖。阻断Livin的表达可促进骨肉瘤细胞的凋亡及增强化疗药物的抗癌作用,这为我们治疗骨肉瘤开辟了一条新的途径。第三部分:体外转录合成特异性Livin siRNA能有效抑制骨肉瘤细胞株MG-63中Livin的mRNA和蛋白表达,抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡,RNA干扰技术为骨肉瘤的治疗提供了一种新策略,Livin能作为诱导骨肉瘤细胞凋亡的分子靶点,Livin基因沉默靶向诱导骨肉瘤细胞凋亡可能作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。