猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原之一,它能干扰宿主I型干扰素(IFN)的表达及I型IFN介导的信号通路,从而抑制感染猪的免疫反应。PRRSV基因组编码的非结构蛋白1α(nsp1α)能抑制I型IFN的产生,在PRRSV感染宿主细胞后的免疫反应中发挥着重要的作用。另外,nsp1α在PRRSV亚基因组的合成中也扮演着重要的角色,但具体机制尚不明确。本研究制备了PRRSV nsp1α的单克隆抗体,并将nsp1α基因连接于慢病毒载体,然后在猪肺泡巨噬细胞传代细胞系(PAM-3D4)中表达。提取宿主细胞的全蛋白后采用iTRAQ技术进行蛋白质组定量分析,共鉴定到1.2倍以上差异蛋白299个。此外,本文还探讨了PRRSV编码的nsp1α在调控宿主天然免疫反应中发挥的作用。主要研究如下:1.PRRSV nsp1α蛋白的原核表达与纯化将PRRSV WuH3株的nsp1α基因插入原核表达载体pET-28a中,构建了原核表达质粒pET-28a-nsp1α,将其转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测证实nsp1α蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,并主要以不溶性包涵体形式存在。对包涵体进行纯化后得到浓度为0.64 mg/m L的nsp1α蛋白。2.PRRSV nsp1α单克隆抗体的制备及亚型分析用纯化的nsp1α原核蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次克隆后共得到11株可持续分泌抗nsp1α抗体的细胞株,分别命名为1A7、1A10、1C3、2D3、2E5、2E7、3B9、3E4、3E11、3G2、4E5。经间接免疫荧光(IFA)和Western Blot检测证实其中7株(2E5、2E7、3B9、3E4、3E11、3G2、4E5)与nsp1α具有良好的特异性反应。亚型检测发现这7株单抗的轻链均为kappa链,其中6株单抗(2E5、2E7、3B9、3E4、3E11、4E5)的重链为IgG1型,只有3G2株单抗的重链为IgG2a型。3.表达PRRSV nsp1α慢病毒的包装及验证为了研究nsp1α对PAM-3D4细胞蛋白表达的影响,将包含nsp1α的表达质粒与慢病毒包装辅助质粒共转染HEK-293T细胞,在转染后24 h和48 h分别收集细胞上清,用Western Blot和IFA进行验证,结果都能检测到目的基因的表达,并且确定了目的基因表达的最佳时间点为感染后72 h。4.PRRSV nsp1α蛋白质组学数据的分析将表达nsp1α的慢病毒感染PAM-3D4细胞,72 h后收集细胞样品,提取细胞蛋白后采用iTRAQ技术进行蛋白质组定量分析,共鉴定到5126个蛋白,差异蛋白在1.2倍以上的有299个,其中上调113个,下调186个,这些差异蛋白涉及细胞生长与繁殖、天然免疫、信号通路等多方面的功能。本文也运用UniProt数据库、IPA蛋白分析软件等对这些差异蛋白进行亚细胞定位、功能聚类、网络互作等分析,阐释了nsp1α在病毒复制、炎症反应及细胞凋亡方面对宿主细胞蛋白的调控作用。