目的：　　 类浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)是树突状细胞的一个重要亚群，因其在病毒刺激下能够产生大量的IFN-α，发挥直接的抗病毒活性，又被称为天然的干扰素α产生细胞(natural interferon producing cell，NIPC)。一方面pDC可以激活NK、NKT等天然免疫细胞，启动固有免疫应答;另一方面，pDC提呈抗原给T细胞，刺激T细胞活化，激活适应性免疫应答;pDC在连接固有免疫应答和获得性免疫应答中发挥着重要的作用。pDC表达Toll样受体(toll-likereceptor，TLR)7和9，并且通过TLR7和TLR9对病毒核酸进行识别，激活下游信号转导通路，进而引起pDC表型及功能的改变，发挥其免疫活性。pDC中的TLR7/9信号转导通路的变化将直接影响pDC的功能。　　 HIV感染后，pDC数量下降，并且与疾病进展有关，这说明pDC在抗HIV感染免疫中发挥着重要的作用。HIV感染后，pDC功能也受到影响，包括活化成熟状态以及细胞因子分泌功能的改变。pDC中的TLR7可以识别病毒的ssRNA，HIV慢性免疫活化引起细菌转位增加，增多的CpG DNA可以被pDC中的TLR9识别。因此，TLR7/9信号通路可能在HIV-1感染后pDC的功能变化中发挥重要作用。HIV感染后pDC中TLR7/9信号转导通路是如何变化的，它是如何影响pDC功能的，目前还不太清楚。本文以HIV-1慢性感染者为实验对象，研究HIV-1慢性感染者pDC活化成熟状态以及细胞因子分泌功能的改变，并且对pDC中TLR7/9信号转导通路关键蛋白的表达进行研究，探讨HIV-1慢性感染者pDC功能改变与TLR7/9信号转导通路的关系，有助于我们深入了解HIV-1慢性感染者pDC功能改变的具体机制，为重建pDC功能提供靶点。　　 方法：　　 1、研究对象　　 HIV-1慢性感染者(chronic HIV-1 infection，CHI)18例，均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊，平均年龄29.5(23-47)岁。入选标准:中国男男性接触感染者，感染时间均在两年以上。其中15例未接受抗病毒治疗，3例已经接受抗病毒治疗。　　 健康对照组(normal control，NC)10例，平均年龄25(23-40)岁，入选标准:血常规及肝功正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性，无免疫系统疾病。　　 2、pDC分泌细胞因子IFN-α、TNF-α、IL-6、IL-12功能的测定　　 取一块24孔板，将将复苏好的约9×106 PBMC分别放入三个孔中，其中一孔加终浓度为1μg/ml的R848，另一孔加终浓度为5μM的ODN2216，剩余一孔为未刺激孔。三孔中均加入相应的Golgi Plug，充分混匀后，将24孔板放入37℃、5％CO2培养箱中培养，孵育6小时。孵育结束后取9支流式管，每孔中的液体平均分至三管中，离心，首先进行表面染色，加入相应的荧光抗体组合（lin1/HLA-DR/CD123），混匀，4℃冰箱避光孵育30分钟。表面染色后，加入Cytofix/Cytoperm solution4℃冰箱中破膜20分钟。破膜结束后，洗涤，各管加入胞内染料组合后充分混匀，4℃冰箱避光孵育30分钟。洗涤，多聚甲醛固定后应用LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。　　 3.pDC表面标志CD40、CD80、CD83、CD86、CCR7的检测　　 复苏约4×106 PBMC（外周血单个核细胞），并平均分配至4个流式细胞管中。做好标记，并分别加入相应的荧光抗体组合，混匀，4℃冰箱避光孵育30分钟。孵育结束后，每管加入2ml PBS重悬，离心，弃上清。混匀后加入含1％多聚甲醛的固定液200μl重悬，应用BD LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。　　 4、pDC中TLR7/9信号转导通路关键蛋白的检测　　 复苏约5×106 PBMC，并平均分配至5个流式细胞管中。做好标记，首先进行表面染色，加入相应的荧光抗体组合（lin1/HLA-DR/CD123），混匀，4℃冰箱避光孵育30分钟。孵育结束后，每管加入2mlPBS重悬，离心，弃上清。表面染色后，每管加入250ul Cytofix/Cytoperm solution4℃冰箱中破膜20分钟。破膜结束后，洗涤，各管加入胞内染料组合后充分混匀，4℃冰箱避光孵育30分钟。洗涤，多聚甲醛固定后应用LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。　　 5、CD4+T细胞绝对值的检测　　 将20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂加入绝对计数管中，逆向加入50μl混匀的抗凝全血，室温避光染色15分钟，加入1×免洗溶血素450μl，室温避光溶血15分钟，应用FACS Calibur流式细胞仪及MultiSET软件检测并分析得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。　　 6、HIV病毒载量测定　　 取1ml EDTA抗凝血浆，采用Roche公司COBAS(R) AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R) System自动载量仪上以实时荧光定量PCR方法测定病毒载量。全部操作按照操作说明书进行。　　 7、统计学分析　　 应用SPSS17.0和Graphpad5.0软件包进行统计分析和图形制作，所有数据以中位数表示，两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，P＜0.05为有统计学意义。　　 结果：　　 一、HIV-1慢性感染者pDC功能的改变:　　 1、TLR7激动剂R848刺激作用下pDC产生IFN-α及炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12的变化情况:　　 TLR7激动剂R848刺激后，HIV-1慢性感染者pDC中IFN-α的产生(2.05;1.075-4.60)显著低于健康对照(5.7;2.175-9.55)(P=0.0327)。　　 TLR7激动剂R848刺激后，HIV-1慢性感染者pDC中炎性细胞因子TFN-a的产生(50.2;35.525-74.9)显著低于健康对照(86.7;79.3-87，825)(P=0.0032);HIV-1慢性感染者IL-6和IL-12的产生与健康对照相比无明显差异(P=0.4012;P=0.9425)。　　 2、TLR9的激动剂ODN2216的刺激作用下pDC产生IFN-α及炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12的变化情况:　　 TLR9激动剂OND2216刺激后，HIV-1慢性感染者pDC中IFN-α的产生(1.45;0-2.9)并未减少，与健康对照(0.8;0-2.37)相比无明显差异(P=0.6105)。　　 TLR9激动剂OND2216刺激后，HIV-1慢性感染者pDC中IL-12的产生(1.4;0-3.925)低于健康对照(3.3;2.05-9.525)，但差异无统计学意义(P=0.0787)。HIV-1慢性感染者TNF-α和IL-6的产生与健康对照相比无明显差异(P=0.5175;P=0.1249)。　　 二、HIV-1慢性感染者pDC表面活化成熟标志表达的变化:　　 流式检测HIV-1慢性感染者pDC表面活化成熟标志CD40、CD80、CD83、CD86、CCR7的表达与健康对照相比均无显著性差异(P=0.77; P=0.75; P=0.17;P=0.58; P=0.42)。　　 HIV-1慢性感染者pDC表面CD40的表达与TLR7或者TLR9激动剂刺激后IFN-α的产生无显著相关性(P=0.08; P=0.48)。　　 三、HIV-1慢性感染者pDC中TLR7/9信号转导通路的变化:　　 1、HIV-1慢性感染者pDC中TLR7与TLR9的表达变化:　　 HIV-1慢性感染者pDC中TLR7的表达(96.6;84.22-97.92)显著高于健康对照(87;57.85-94.4)(P=0.0396)。　　 HIV-1慢性感染者pDC中TLR9的表达(93.3;80.4-96.95)也显著高于健康对照(66.05;50.05-85.85)(P=0.0370)。　　 2、HIV-1慢性感染者pDC中IRF7与NF-kB的表达变化:　　 HIV-1慢性感染者pDC中IRF7的表达(36.1;13.3-56.42)显著低于健康对照(52.85;36.72-74.95)(P=0.0466)。 HIV-1慢性感染者pDC中NF-kB的表达与健康对照相比无统计学差异(P=0.7352)。　　 结论：　　 1、TLR7激动剂刺激下，HIV-1慢性感染者pDC产生的IFN-α以及TNF-α的能力低于健康对照。　　 2、HIV-1慢性感染者pDC中IRF7的表达下调可能是导致TLR7激动剂刺激下IFN-α及TNF-α减少的原因。　　 3、TLR9激动剂刺激下，HIV-1慢性感染者细胞因子的产生正常。