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研究目的: 鉴定ITGB6基因5’侧翼主要转录调控区域,探讨调控口腔鳞癌细胞中ITGB6基因基本转录活性的主要转录调控元件及转录因子。 材料和方法: 利用生物信息学方法预测ITGB6基因的转录起始位点、翻译起始位点及5’侧翼主要转录调控区域。利用PCR方法从口腔鳞癌细胞中扩增ITGB6基因5’侧翼区,构建含有ITGB6基因5’侧翼区不同长度片断的荧光素酶报告基因质粒,转染工具细胞人胚肾细胞293T和HEK293检测荧光素酶报告基因质粒启动子活性,进一步转染人口腔鳞癌细胞株TCA8113和SAS,检测ITGB6基因5’侧翼区不同长度片断在口腔鳞癌细胞中的活性,确定调控口腔鳞癌细胞中ITGB6基因基本转录活性的主要调控区;利用生物信息学方法并结合相关文献预测调控口腔鳞癌细胞ITGB6基因基本转录活性的可能顺式作用元件及与之结合的转录因子;利用定点突变、凝胶迁移阻滞实验和染色质免疫共沉淀方法确定调控口腔鳞癌细胞ITGB6基因基本转录活性的主要顺式作用元件及与之结合的转录因子。 结果: 1.生物信息学预测ITGB6基因主要转录调控元件位于5’侧翼区-946/+167区域,转录起始位点位于翻译起始位点上游166bp。 2.成功构建5个ITGB6基因5’侧翼区不同长度片断荧光素酶报告基因质粒,分别命名为pGL2-B6(-946/+172),pGL2-B6(-458/+172),pGL2-B6(-187/+172),pGL2-B6(-35/+172)和pGL2-B6(+22/+172)。 3.ITGB6基因5’侧翼区不同长度片断荧光素酶报告基因质粒基本启动子活性分析:重组报告基因质粒转染分别293T和HEK293细胞,当ITGB6基因5’侧翼区序列从-946截短到-458时,启动子转录活性均显著性增加,分别为52.50%,61.25%;-458截短到-187时,启动子转录活性均显著性降低,分别为65.09%,88.51%;当-35截短到+22时,启动子转录活性几乎完全丧失;而-187截短到-35时,启动子转录活性差异无统计意义。 4.口腔鳞癌细胞中ITGB6基因基本转录活性主要转录调控区的定位分析:口腔鳞癌细胞中,ITGB6基因5’侧翼片断-458/+172具有最强的启动子转录活性;当ITGB6基因5’侧翼区序列逐渐截短时,启动子转录活性呈逐渐降低趋势,其中从-458截短到-187时,启动子转录活性的降低幅度最大;从-35截短到+22时,启动子转录活性几乎完全丧失。接着,我们进一步发现在口腔鳞癌细胞中当ITGB6基因5’侧翼区序列的-458截短到-326时,启动子转录活性无显著性差异;当ITGB6基因5’侧翼区序列从-326截短到-187,启动子转录活性在两种口腔鳞癌细胞株中均显著下降。提示ITGB6基因在口腔鳞癌细胞中的基本转录活性调控区主要位于ITGB6基因5’侧翼区序列的-326~-187区域和-35~+22。 生物信息学分析显示ITGB6基因-326~-187区域具有Stat3、SRF、C-MYB、CEBPα(CEBP)、AP-1和YY-1等转录因子潜在的结合位点;进一步利用定点突变技术,发现转录因子SRF、Stat3和CEBP等的潜在的结合位点可能涉及口腔鳞癌中ITGB6基因基本转录活性调控。 而在-35~+22区域,生物信息学分析发现具有Oct-1、IRF-4和TBP等转录因子潜在的结合位点,进一步利用定点突变技术,发现转录因子TBP的潜在的结合位点可能涉及口腔鳞癌中ITGB6基因基本启动子活性的调控。 5.口腔鳞癌细胞中参与调控ITGB6基因基本转录活性的转录因子的鉴定分析:凝胶迁移变动分析实验结果显示含有SRF,CEBP,Stat3结合位点序列的探针与TCA8113细胞核抽提物均发生迁移阻滞;染色质免疫共沉淀结果显示,在TCA8113细胞中,SRF,CEBP,Stat3三种转录因子和ITGB6启动子-326~-187区域在TCA8113细胞中有体内结合,而转录因子TBP结合在-35~+22区域。 结论: 1.口腔鳞癌细胞中,-326~-187区域和-35~+22区域是ITGB6基因基本转录活性的主要调控区。ITGB6基因5’侧翼区具有典型的基因转录调控区的特点,其中-326/-187区域是ITGB6启动子调节性启动子区域,-35~+22区域是ITGB6核心启动子区域,-946/-458区域是远距离调控元件区域。 2.转录因子SRF、CEBP、Stat3和TBP参与在口腔鳞癌细胞中ITGB6基因基本转录活性的调控,其中SRF、CEBP和Stat3结合在ITGB6基因-326~-187区域,而转录因子TBP结合ITGB6基因在-35~+22区域。