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目的:1、从体内水平上研究晚期糖基化终产物受体(the receptor for advanced glycation end products,RAGE)在重症中暑急性肺损伤(acute lung injury,ALI)发病机制中的作用;2、从细胞水平上研究RAGE在热打击引起单层人脐静脉内皮细胞(human umbilical venous endothelial cells,HUVEC)屏障功能障碍中的作用及其信号转导通路,为临床上治疗重症中暑ALI寻找新的靶点。方法:1、应用RAGE基因敲除小鼠构建重症中暑动物模型,通过检测支气管肺泡灌洗液(Bronchial Alveolar Lavage Fluid,BALF)中白细胞、中性粒细胞计数及蛋白含量、肺湿/干比、肺组织病理学及电镜检查、动脉血气分析等,研究RAGE在重症中暑小鼠急性肺损伤发病机制中的作用。2、RAGE在热打击引起内皮细胞屏障功能障碍中的作用及其信号转导通路2.1 RAGE在热打击引起内皮细胞屏障功能障碍中的作用2.1.1构建体外HUVEC热打击模型,通过检测单层内皮细胞跨膜电阻值(transendothelial electrical resistance,TEER)研究不同温度、不同热打击时间以及不同复温时间对单层HUVEC通透性的影响;2.1.2通过Western blot方法检测不同温度、不同热打击时间以及不同复温时间对HUVEC中RAGE蛋白表达的影响;2.1.3通过转染RAGE siRNA抑制RAGE的表达,研究RAGE对热打击引起的HUVEC屏障功能障碍的影响;2.2 MAPK信号通路在RAGE介导的热打击引起HUVEC通透性变化中的作用2.2.1 Western blot方法检测热打击对HUVEC中JNK、ERK、P38的磷酸化水平及蛋白表达的影响;2.2.2 通过转染 RAGE siRNA 或加入 RAGE blocking antibody 预孵育抑制 RAGE的表达,或转染RAGE基因过表达腺病毒,通过Western blot方法检测RAGE在介导热打击引起的JNK、ERK、P38磷酸化水平变化中的作用;2.2.3在HUVEC中加入JNK、ERK、P38抑制剂共孵育,通过检测TEER研究MAPK信号通路在热打击引起HUVEC通透性变化中的作用;2.3 HSF1、c-Jun在介导热打击引起RAGE蛋白表达变化中的作用2.3.1生物信息学方法分析预测转录因子HSF1、c-Jun与RAGE基因启动子区可能存在的结合位点2.3.2热应激条件下HSF1、c-Jun磷酸化水平及蛋白表达的变化2.3.3通过转染HSF1 siRNA抑制HSF1的表达,或转染HSF1基因过表达腺病毒,通过Western blot方法研究HSF1在介导热打击引起RAGE蛋白表达变化中的作用;2.3.4加入AP-1抑制剂抑制c-Jun的表达,通过Western blot方法研究c-jun在介导热打击引起RAGE蛋白表达变化中的作用;2.3.5 通过染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)分析c-Jun转录因子与RAGE基因启动子区之间的相互作用关系。结果:1、RAGE基因敲除对重症中暑小鼠急性肺损伤的保护作用1.1 RAGE基因敲除可明显降低重症中暑小鼠BALF中白细胞计数、中性粒细胞计数及蛋白含量;1.2 RAGE基因敲除可明显降低重症中暑小鼠肺组织的湿/干重比值及肺含水量;1.3 RAGE基因敲除可明显改善重症中暑小鼠肺组织的病理改变及超微结构的破坏;1.4 RAGE基因敲除可明显改善重症中暑小鼠动脉血Pa02、PaC02、PH值的异常变化。2、RAGE在热打击引起内皮细胞屏障功能障碍中的作用及其信号转导通路2.1 RAGE在热打击引起内皮细胞屏障功能障碍中的作用2.1.1热打击可以时间温度依赖的方式引起HUVEC通透性增高;2.1.2热打击以时间温度依赖的方式使HUVEC中RAGE蛋白的表达增加;2.1.3 RAGE基因的表达在热打击结束后即显著升高;2.1.4抑制RAGE的表达对热打击引起的HUVEC通透性增高有显著的抑制作用。2.2 MAPK信号通路在RAGE介导的热打击引起HUVEC通透性变化中的作用2.2.1热打击可使HUVEC中JNK、ERK、P38的磷酸化水平增高,而预转染RAGE siRNA可显著抑制热打击引起的ERK、P38磷酸化水平增高,但对JNK的磷酸化无明显影响;2.2.2过表达RAGE基因可使热打击引起的ERK、P38磷酸化水平增高更明显,但对JNK的磷酸化无明显影响;2.2.3 RAGE中和抗体可显著抑制热打击引起的ERK、P38磷酸化水平增高;2.2.4 ERK、P38通路抑制剂可对抗热打击引起的HUVEC通透性增高;2.3 HSF1、c-Jun在介导热打击引起RAGE蛋白表达变化中的作用2.3.1 MatInspector软件预测的结果显示RAGE基因启动子区可能存在与c-Jun、HSF1的结合位点;2.3.2热打击可使HUVEC中HSF1、c-Jun磷酸化水平增高;2.3.3预转染HSF1 siRNA可使热打击引起的RAGE蛋白表达增高更显著;而预转染Ad-HSF1可显著抑制热打击引起的RAGE蛋白表达水平增高;2.3.4 AP-1抑制剂可显著抑制热打击引起的RAGE蛋白表达水平增加2.3.5 ChIP实验结果显示热应激条件下c-Jun与RAGE基因启动子区相结合,而在正常情况下未发现两者之间有相互作用发生。结论:1、RAGE基因敲除对重症中暑小鼠急性肺损伤起明显的保护作用。2、热打击可以时间和温度依赖的方式引起单层HUVEC通透性增高;3、热打击通过使RAGE蛋白表达增加引起单层HUVC通透性增高;4、ERK、P38 MAPK参与了 RAGE介导的热打击致HUVEC通透性增高的信号转导通路;5、c-Jun通过与RAGE基因启动子区相结合促进热应激条件下RAGE蛋白的表达增加,而HSF1对于热应激条件下RAGE蛋白的表达起抑制作用,二者共同调节热应激情况下HUVEC通透性的变化;