研究背景与目的骨肉瘤是发病率约为骨恶性肿瘤的40%左右，仅次于软骨肉瘤，发病的机理尚不明了。骨肉瘤好发于青少年，恶性程度高，局部浸润、早期转移和复发的倾向高，预后极差。由于骨肉瘤早期转移率高，早期诊断及早期治疗成为治愈该瘤的关键。S100家族是一类酸性的，分子量较小，能与钙结合的蛋白质，该家族目前报道发现至少有25个成员，该家族成员结构比较保守，都具有EF-手型结构，能与游离钙或者靶蛋白结合后产生多种生理学作用，如：参与细胞增殖与凋亡，调节酶活性或者经蛋白质的磷酸化等参与多种信号途径等。该家族中有21个成员的基因定位在稳定性较差、易发生染色体重排的人染色体1q21上，故大量的文献报道S100家族与多种高发性肿瘤，如骨肉瘤、卵巢癌、乳腺癌等关系密切。本课题拟研究重组hS100A6对人骨肉瘤细胞143B增殖、迁移、侵袭等方面的影响，并探讨重组hS100A6对该细胞中Wnt/β-catenin及PI3K-AKT信号途径的影响，从而为骨肉瘤发生发展的分子机制的深入研究奠定基础。方法1.质粒pGST-GST-HRV3C-hS100A6的构建与鉴定：以pHAHA-hS100A6为模板，高保真PCR扩增携带HRV3C酶切位点编码序列的hS100A6基因片段，插入至原核表达载体pGST-moluc，构建pGST-HRV3C-hS100A6；将该质粒经氯化钙法转入宿主大肠杆菌BL21，增菌后提取质粒作限制性内切酶的双酶切以鉴定构建的重组质粒，最后做测序鉴定。2.重组hS100A6的制备与鉴定：扩增含重组质粒pGST-HRV3C-hS100A6的BL21，利用异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其表达融合蛋白，然后冰浴超声裂菌，谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠（Glutathione Sepharose4B beads）分离纯化出融合蛋白GST-HRV3C-hS100A6，经GST-HRV3C蛋白酶4℃酶切过夜，再用谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠清除体系中的GST-HRV3C蛋白酶和被切下的GST标签。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和Western-blot鉴定重组蛋白，应用分光光度仪对重组蛋白进行蛋白定量，0.22μm滤膜过滤除菌后分装，-80℃保存备用。3.分别用不同浓度的重组hS100A6（1μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml）处理细胞，MTT法检测其对细胞增殖的影响；选择合适浓度作为后续实验的干预浓度，随后用MTT法、transwell小室（带或不带基质胶）和Hoechst33258染色检测重组hS100A6对143B细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。4.Western blot检测重组hS100A6对人骨肉瘤细胞143B的β-catenin水平、PI3K-AKT信号途径标志蛋白p-AKT（Ser473）及其下游蛋白GSK3β的磷酸化水平的影响；再运用信号途径抑制剂抑制该信号途径活性，再观察重组hS100A6对细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。结果1.构建的pGST-HRV3C-hS100A6质粒，经双酶切鉴定和测序分析证实是正确的；转化后的菌株经IPTG诱导能够表达相对分子质量约36KDa的蛋白质；经纯化、超滤置换缓冲液和GST-HRV3C酶切，再用琼脂糖4B球珠去除GST-HRV3C和GST标签；得到相对分子质量约10.5KDa的蛋白质（重组hS100A6），经Quantityone软件检测其纯度达93.2%；Western Blot显示S100A6单克隆抗体可以对该蛋白特异识别；该蛋白产量约为4mg/L菌液。2.浓度依赖MTT显示：在浓度范围内（1μg/ml到90μg/ml）：30μg/ml的重组hS100A6能明显促进143B细胞的增殖，而90μg/ml的重组S100A6则抑制其增殖（P0.05）。本课题拟对其促骨肉瘤作用进行研究，故选用30μg/ml作为后续实验的干预浓度。3. hS100A6对143B细胞的作用：1）MTT显示重组hS100A6处理143B细胞后从第二天起到第五天，实验组的A492nm值较对照组分别增加56.9%，41.4%，39.3%，72.4%（P0.05），提示hS100A6有促进143B细胞增殖的作用，且有一定程度的时间依赖性；2）Transwell（带基质胶）侵袭实验显示24h穿过小室膜的实验组细胞数较对照组增加145.1％(P0.05)，提示S100A6具有促进143B细胞侵袭能力的作用；3）Transwell（不带基质胶）迁移实验显示实验组24小时穿膜细胞较对照组增加270.3%（P0.05），提示hS100A6促进143B细胞迁移；4）Hoechst染色显示：重组hS100A6处理的143B细胞在48h的细胞凋亡率为4.9%，而对照组为5.8%，差异无显著性（P>0.05），提示S100A6对143B细胞的凋亡无明显影响。4. Western blot结果显示：1）当重组hS100A6作用于143B细胞24h后，实验组β-catenin的校正灰度值为1.69±0.024，对照组β-catenin的校正灰度值为0.89±0.051，实验组较对照组增加89.9%（P0.01）；提示重组hS100A6上调143B细胞的β-catenin水平；2）实验组p-GSK3β的校正灰度值为1.15±0.021，空白对照组p-GSK3β的校正灰度值为0.25±0.016，实验组较对照组增加360.3%（P0.01）；提示重组hS100A6上调143B细胞的GSK3β的磷酸化水平；3）实验组p-AKT（Ser473）的校正灰度值为0.67±0.021，空白对照组p-AKT的校正灰度值为0.35±0.026，实验组较对照组增加91.4%（P0.01）；提示重组hS100A6上调143B细胞的AKT的磷酸化水平。5. Western blot结果显示：hS100A6处理组p-AKT的校正灰度值为1.29±0.022；hS100A6与LY294002共同处理组p-AKT的校正灰度值为0.21±0.022，hS100A6处理组较共同处理组增加了514.3%（P0.01）；提示10μM浓度LY294002能够有效地抑制143B细胞中的PI3K-AKT信号途径；利用该抑制剂在阻断该信号途径后：MTT显示抑制剂组较实验组的A492nm值从第二天到第四天分别减少37.2%，18.7%，42.9%（P0.05）。Transwell侵袭实验显示抑制剂组较实验组细胞24h穿膜数减少48.8％（P0.05）；Transwell迁移实验显示抑制剂组较实验组细胞24h穿膜数减少50.2％（P0.05）。提示激活PI3K-AKT是S100A6促进143B细胞增殖、侵袭及迁移的机制之一。结论1.成功构建质粒pGST-GST-HRV3C-hS100A6，将其转化入大肠杆菌表达载体BL21后，经诱导表达、纯化、酶切和再纯化等过程，获得高纯度的hS100A6，且该重组蛋白具有生物学活性。2.30μg/ml浓度的重组hS100A6能够促进人骨肉瘤细胞143B的增殖、侵袭及迁移过程；而90μg/ml浓度的重组和S00A6能抑制其增殖，重组hS100A6对该细胞系具有双向作用。3.外源性hS100A6能够上调人骨肉瘤细胞143B胞内β-catenin水平，这可能是其促进人骨肉瘤细胞143B细胞的增殖、侵袭及迁移的机制之一；同时，S100A6引起的GSK3β磷酸化水平的增加可导致β-catenin降解复合物的解聚，这是β-catenin升高的机制之一；而S100A6引起的GSK3β的磷酸化增加可能部分经由PI3K-AKT途径的激活来介导的。4.激活PI3K-AKT途径是外源性hS100A6增强人骨肉瘤细胞143B细胞的增殖、侵袭及迁移能力的又一机制。