研究背景:骨关节炎(osteoarthritis,OA)是最常见的关节炎类型。它是一种致残、迟发和退行性疾病,特点是关节软骨和滑膜炎症消失,导致关节僵硬、肿胀、疼痛和活动性丧失。从流行病学的角度来看,目前骨关节炎影响全世界约半数的年龄超过65岁的人群,被认为是首要致残原因之一。尽管人工关节置换能有效地使晚期骨关节炎患者恢复关节功能、提高生活质量,然而在疾病早期由于缺乏特定的症状或体征,很难诊断。因此,迫切需要新的生物标志物用来诊断和治疗早期骨关节炎。骨关节炎最初被认为是一种与炎症无关的磨损性疾病,而如今由于分子生物学的出现,它正被重新定义为一种复杂的、多因素疾病。骨关节炎发生过程中,软骨损伤与炎症基因上调有关,后者可以通过多种信号通路的转导引发软骨损伤。此外,炎症因子还可以导致包括MMP和整合素在内的蛋白酶类表达增加,使关节软骨胞外基质发生降解而加重病情。另外,软骨细胞是关节软骨的重要组成成分,正常情况下软骨细胞的代谢十分活跃,对维持软骨的正常结果和功能有着重要作用。当炎症因子通过MAPK、NF-Kappa B等胞内信号通路的转导传递给转录因子,使软骨细胞分化变为纤维细胞样的表型,促使细胞数量减少,周围组织发生纤维化。总之,骨关节炎的发生涉及众多分子和信号通路的变化,具体机制尚未阐明。因此有必要对骨关节炎发生和进展的分子机制进行深入探讨,以便为患者发现新的有效治疗策略。长非编码 RNA(Long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度大于 200 个核苷酸的内源性RNA。目前人们发现lncRNA异常表达在调节包括骨关节炎在内的各种炎症性疾病中起着至关重要的作用。表达谱分析显示,骨关节炎患者中有4067个表达量上调的lncRNA和2231个lncRNA下调,提示lncRNA可能在骨关节炎发病机制中发挥重要作用,可能作为潜在的生物标志物或治疗靶点。最近的研究表明,lncRNA在软骨损伤中起着重要的调节作用,可以促进骨关节炎中软骨细胞胞外基质的降解。例如,lncRNA CIR可以通过结合miR-27b,促进软骨细胞胞外基质降解。另一项研究揭示了 lncRNA-UFC1通过调节miR-34a可促进骨关节炎细胞增殖,减少软骨细胞凋亡。HULC是一种重要的lncRNA,可以调控细胞凋亡并在多种癌症的发生中作为致癌基因发挥作用。HULC在细胞中的表达水平升高可诱导细胞增殖和肿瘤生长,并导致肿瘤抑制因子p18的下调。此外,新的证据表明HULC的下调可能与骨关节炎发病过程中软骨细胞死亡有关。然而,HULC在骨关节炎中的表达、作用及其调控机制在很大程度上是未知的。研究目的:本研究旨在探讨HULC对骨关节炎的调节作用。ATDC5是小鼠软骨形成细胞系,常被用于构建骨关节炎炎症损伤模型。因此,我们利用TNF-α来处理ATDC5细胞,构建炎症损伤模型来模拟骨关节炎发生过程。然后在TNF-α处理的ATDC5细胞中测定了 HULC在细胞增殖、凋亡和促炎细胞因子中的作用以及对NF-κ B和p38MAPK信号通路进行了研究,以揭示其潜在分子机制。实验方法:本实验纳入了 20例骨关节炎患者,用实时荧光定量PCR检测其病患软骨组织和正常软骨组织中促炎细胞因子IL-6、IL-8、MCP-1 mRNA的表达水平及HULC的表达量。构建TNF-α诱导的ATDC5细胞炎症损伤模型,研究HULC对骨关节炎的调节作用。用不同浓度的TNF-α(0、10、20和40 ng/ml)处理ATDC5细胞,CCK-8实验测定细胞活力,计算出IC50浓度用于后续实验。随即用20 ng/ml TNF-α处理细胞,流式细胞分析技术及western blot检测凋亡相关因子Caspase-3和Caspase-9的表达来评估细胞凋亡,此外,定量PCR、western blot和酶联免疫吸附试验用于测定促炎细胞因子IL-6、IL-8和MCP-1的表达和分泌情况。为进一步研究HULC对TNF-α损伤的ATDC5细胞的影响,我们用不同浓度的TNF-α处理ATDC5细胞,定量PCR测定细胞中HULC的相对表达量。pc-HULC、sh-HULC转染ATDC5细胞,用来改变HULC的表达,继而检测HULC过表达、干扰后细胞活力、凋亡和促炎细胞因子的变化。检测HULC过表达、抑制后,ATDC5和人原代软骨细胞内miR-101的相对表达量。利用Targetscan工具预测HULC和miR-101可能的作用位点,将HULC基因的3’-UTR结合序列进行突变,并将产生的突变型和野生型HULC分别克隆到荧光载体上,与miR-101 mimics共同转染细胞,双荧光素酶报告基因实验分析证实HULC和miR-101的直接相互作用。随后,我们利用生物素-亲和素Pull-down系统研究了二者的相互作用:生物素标记的野生型miR-101基因转染ATDC5细胞,亲和素介质与细胞裂解液共同孵育用来特异性吸附miR-101及与之与相互作用的基因,定量PCR测定HULC的富集表达量;再利用生物标记的HULC探针进行反向Pull-down实验。接下来,我们利用抗Ago2抗体进行RNA免疫沉淀实验,进一步探讨HULC与miR-101的相互作用。miR-101 mimics和pcHULC同时转染ATDC5细胞用来过表达miR-101和HULC,RT-qPCR检测转染效率。用TNF-α处理ATDC5细胞,检测miR-101过表达是否可以影响HULC引起的细胞活力、凋亡以及IL-6、IL-8和MCP-1表达变化。用miR-101 inhibitor转染细胞,检测细胞功能变化,包括细胞活力、凋亡、活性Caspase-3和活性Caspase-9的表达以及促炎细胞因子的表达。最后,我们通过western blot检测NF-κB和p38/MAPK信号通路中重要成分蛋白的磷酸化水平,评估HULC及miR-101对TNF-α处理的ATDC5细胞中NF-κB和p38/MAPK信号通路的影响。实验结果:定量PCR结果显示,患者关节炎软骨组织中IL-6、IL-8、MCP-1在mRNA水平上的表达明显高于正常软骨组织(P<0.01或P<0.001)且关节炎软骨组织中HULC的表达水平显著降低(p<0.001)。TNF-α处理ATDC5细胞可以显著降低了 HULC的表达并降低细胞活力,且IC50浓度约为20 ng/ml。选用20 ng/ml的TNF-α处理ATDC5细胞,用于后续实验,发现细胞凋亡水平显著上升、活性Caspase-3和Caspase-9的表达增加、细胞中IL-6、IL-8和MCP-1在mRNA和蛋白水平上的表达量、分泌量均显著增加,这些表明TNF-α诱导的ATDC5细胞炎症损伤模型构建成功。在HULC过表达可以显著提高TNF-α处理的ATDC5细胞的活力并抑制了细胞凋亡,且可以引起活性Caspase-3/-9的下调,同时抑制了 IL-6、IL-8和MCP-1在mRNA和蛋白水平的表达量以及细胞外的分泌水平;干扰HULC的表达对TNF-α诱导的细胞损伤的影响,与其过表达对细胞的作用相反(p<0.01或p<0.001)。同样,HULC在原代软骨细胞中也出现了类似的结果,表明HULC可以减轻TNF-α诱导的软骨细胞炎症性损伤。与对照组相比,HULC过表达明显降低了 miR-101的表达水平(p<0.05);而抑制HULC的表达则显著上调了 miR-101的表达水平(P<0.001)。我们还发现pc-HULC和sh-HULC转染同样可以显著改变人原代软骨细胞中miR-101的表达量。通过预测,HULC可以与miR-101直接结合,双荧光素酶报告基因实验分析显示miR-101 mimics可以抑制野生型HULC转染组的荧光素酶活性,而突变型HULC组细胞没有明显变化。Pull-down实验表明经亲和素吸附后,系统中HULC的浓度增加(p<0.001),而突变的miR-101则不能引起HULC量的变化,提示HULC与miR-101有直接相互作用,反向Pull-down也得到了相似的实验结果。另外,在有Ago2表达的ATDC5细胞中,用抗Ago2抗体富集到的HULC和miR-101均明显上调(p<0.01)。以上结果表明,HULC在ATDC5细胞中通过结合miR-101而发挥作用,HULC和miR-101之间可能存在相互抑制。在TNF-α处理的ATDC5细胞中,miR-101过表达显著逆转了 HULC对细胞活力、凋亡和 IL-6、IL-8、MCP-1 表达的影响(p<0.05,p<0.01 或 p<0.001)。这些数据表明,miR-101过表达抑制了 HULC对TNF-α损伤的ATDC5细胞的保护作用。然而,用miR-101 inhibitor抑制其在细胞中的表达,TNF-α处理的ATDC5细胞活力明显增强、细胞凋亡减少且活性Caspase-3和活性Caspase-9的表达降低(P<0.01)。此外,IL-6、IL-8和MCP-1的mRNA和蛋白水平的表达均受到miR-101 inhibitor 的抑制(p<0.05 或 p<0.01)。提示 miR-101 inhibitor 对 TNF-α处理的ATDC5细胞具有保护作用。TNF-α处理后,IκBα、p65、p38MAPK、ERK1/2 和 JNK1/2 的磷酸化水平显著上调(P<0.001)。HULC过表达可以下调TNF-α处理后上述蛋白的磷酸化水平。然而,过表达 miR-101 可以逆转 HULC 对 IκBα、p65、p38MAPK、ERK1/2 和JNK1/2磷酸化的抑制作用(p<0.01或p<0.001)。不同给药组非磷酸化状态的t-IKBα、t-p65、t-p38MAPK、t-ERK1/2、t-JNK1/2 无明显变化。以上数据表明,HULC可通过下调miR-101抑制TNF-α处理的ATDC5细胞中NF-κB和p38MAPK信号通路转导,而对细胞炎症损伤起到保护作用。实验结论:综上所述,我们的实验结果表明lncRNA HULC通过与miR-101相互作用并抑制其表达,抑制了 NF-κB和MAPK信号通路的激活,从而保护ATDC5细胞免受TNF-α诱导的炎症损伤。这些结果表明,lncRNAHULC可能是骨关节炎发病机制中的一个重要调节因子,也可能是诊断和治疗骨关节炎的一个新的生物标志物。