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犬瘟热(Canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)感染引起食肉科动物死亡的急性、高度接触性传染病。近年来，随着全球环境变化、动物栖息地的人为频繁干预及病毒的进化，CDV的自然宿主已由传统的犬科、浣熊科和鼬科扩大到猫科、灵猫科等所有陆地食肉科动物，此外也有偶蹄目、海豹和非人灵长类自然感染CDV的报道。CDV给全球动物养殖业和生物多样性带来极大损失和危害的同时，其社会公共危害性越来越受到人们重视。传代细胞系上缺少CDV病毒受体，人工分离培养病毒十分困难，导致人们对病毒的病原学与免疫研究认知较其它病毒而言发展相对缓慢，特别是在免疫预防方面一直沿用上世纪50年代研制的CDV。因此，当前构建高效分离CDV的敏感细胞系，建立病毒的反向遗传操作平台，分离研究当前流行犬瘟热野毒株的特性，分析野毒株与商业疫苗毒株抗原蛋白分子特性及抗原蛋白差异，开展有效安全成本低廉犬用疫苗或佐剂的研制具有重大意义，对预防控制国内犬瘟热疫情蔓延具有重要现实意义。I表达犬瘟热病毒SLAM受体的敏感细胞系构建及其病毒的分离与鉴定鉴于传统的CDV分离培养方法有分离率低、耗时长、成本高等缺陷，因此尽快建立方便、快捷分离培养CDV的方法显得尤为重要。本试验成功构建了表达犬瘟热病毒受体SLAM的Vero/DogSLAM细胞系，并用该细胞系分离到猴源(Monkey-BJ01-DV)和犬源(SC-CDV)CDV野毒各一株，探索了不同动物来源CDV对不同种属动物SLAM利用情况，比较了同时期猴源和犬源流行犬瘟热毒株的重要蛋白基因序列。结果显示本试验构建的Vero/DogSLAM敏感细胞系在接种病料36-48h后就能出现典型CPE，缩短病毒分离时间，提高CDV分离率，将有力地推动对犬瘟热病毒分子特征的研究。此外，我们还比较了不同种属来源CDV受体病毒病毒分离的敏感性，研究发现猴源和犬源CDV都能高效利用猴和犬SLAM受体，但是猴源CDV更倾向于利用猴SLAM，犬源CDV对犬SLAM亲和力比对猴SLAM高；Monkey-BJ01-DV病毒H蛋白基因与国内同期流行的犬源和狐狸源CDV病毒的同源性最高达98.4％；且与同期流行食肉科源CDV相比，三株猴源CDV-H蛋白有E276V、Q392R、D435Y和I542F4个特异性突变位点。II现行不同疫苗株犬瘟热病毒免疫效果评价及其H蛋白基因特性分析研究虽然减毒活疫苗早已用于犬瘟热的防控，近年来国内家养动物和养殖场的犬科、鼬属经济动物经常暴发犬瘟热疫情。有学者认为是目前疫苗所用毒株与流行野毒株抗原性有所差异，野毒株能逃避现行所用疫苗产生的免疫保护而致病。本实验为了解目前常用犬用疫苗中CDV毒株与国内流行野毒株H基因的差异性，对分别来自法国、俄罗斯、荷兰、韩国及国产的5种犬用疫苗在犬和狐狸上对以上疫苗进行了免疫效果评价；同时对其CDV-H基因进行序列测定，与传统疫苗株和国内野毒株的H基因进行比较。结果显示证实韩国疫苗使用毒株的免疫原性最好。法国疫苗使用Onderstepoort株；荷兰疫苗使用Vaccine strain JP株；国产疫苗使用的毒株与Snyder Hill同源性最高；俄罗斯疫苗使用的毒株也同属于北美疫苗株，但是于传统的疫苗株亲缘性低，自成一个分支；韩国疫苗使用毒株与野毒株同源性最高。序列分析表明国内流行野毒株与现行使用疫苗毒株H蛋白的同源性只有87－90％，疫苗株H蛋白一般有4－7个糖基化位点，而国内流行野毒株已经进化出9个糖基化位点。韩国疫苗使用毒株H蛋白含有野生株特有的g3(309)糖基化位点。H基因序列的多样性可能对不同毒株H蛋白的中和表位产生重要的影响。为近一步明确犬瘟热病毒强毒株与弱毒株间的抗原性差异，我们分析了决定CDV病毒抗原性的H糖蛋白。本试验利用2株对疫苗株和野生株H蛋白表现不同亲和力的单抗：d-7和JD-7，通过点突变和基因重组方法探索野生株和疫苗株H蛋白抗原性差异位点。最后通过Phyre2软件构建了CDV-H蛋白3D结构模型，比较分析了疫苗株和野生株H蛋白空间结构，发现H蛋白的234－246aa、302－313aa及415-418aa之间野生株和疫苗株存在3处空间构象差异域，初步推断这三处差异导致疫苗株和野生株抗原性差异区域。本试验揭示国内常用疫苗毒株背景，发现其与国内流行野毒株H蛋白同源性较低，对今后CD防治措施制定提供一定指导作用，及对今后犬用疫苗毒株筛选工作提供一定的借鉴意义。III表达IL-18重组犬瘟热病毒感染性克隆构建与初步应用研究犬瘟热疫苗株和野毒株之间抗原性差异，使进化野毒株可能逃避疫苗株产生的免疫保护。因此有必要在增强犬用疫苗刺激机体产生更多细胞免疫反应着手拓展开发新型犬用疫苗或佐剂研究。白细胞介素18(Interleukin-18, IL-18)在诱导机体TH1型细胞产生IFN-γ对抗胞内寄生虫、细菌和病毒感染及抗肿瘤生长中具有重要作用，其作为一种疫苗佐剂或抗癌制剂被广泛研究应用。但IL-18缺乏自身信号肽，借助Caspases-1裂解形成成熟性IL-18发挥其生物学功能。研究显示粘附犬IL-12p40信号肽(cIL12ss)的成熟型IL-18能非依赖caspases-1裂解形成成熟型IL-18。本试验中构建了粘附人IL-2信号肽(hIL2ss)的犬IL-18表达系统，研究发现该表达系统也能非依赖caspases-1裂解形成成熟型犬IL-18，且粘附hIL2ss表达系统表达的IL-18刺激犬免疫细胞分泌IFN-γ量为863pg/ml，而cIL-12ss表达系统为424pg/ml，说明本试验构建IL-18表达系统更成功有效。随后我们构建了粘附hIL2ss的犬/鼠IL-18的重组犬瘟热病毒感染性克隆，成功拯救2株重组病毒rCDV-hIL2ss-cIL18和rCDV-hIL2ss-mIL18。结果显示rCDV-hIL2ss-cIL18感染细胞中即能检测到IL-18前体proIL-18(22kDa)蛋白又能检测到成熟型IL-18(18kDa)，而rCDV-hIL2ss-mIL18感染细胞中只能检测到成熟型IL-18。这2株重组病毒保持与母本病毒相似的生长动力学特性；重组病毒感染细胞后能向细胞上清释放有生物学活性的IL-18，能刺激犬或鼠免疫细胞分泌IFN-γ。本实验构建的表达IL-18重组犬瘟热病毒可能是一种新的犬或鼠用疫苗佐剂和抗癌候选制剂。