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人心肌肌钙蛋白I (human cardiac troponin I, hcTnI)是临床检测心肌损伤及其预后提供诊断的生物学指标,由于其窗口期长,出现早,故被称为临床诊断心肌梗死(AMI)的“金指标”。目前临床使用的检测cTnI的试剂盒或试纸条,大都来自进口或是进口原料再组装的,价格昂贵；此外由于不同的厂家生产,使得检测结果存在很大差异。因此,开发自主研制国产化和标准化的cTnI的检测产品,十分必要。随着基因工程的发展,本研究用基因工程方法构建了重组cTnI蛋白原核表达体系pET-11a-cTnI-BL21(DE3),未加任何其他标记标签,使表达的cTnI蛋白更忠实于其生物学特性。利用响应曲面法(RSM)优化重组表达蛋白的表达条件,得到回归方程预测cTnI的最佳表达条件：诱导时机OD600=1.0,诱导温度为30.0℃,诱导时间为4.5h,验证实验得到优化后目的蛋白占总蛋白的表达比例是32.63%,提高了8.4%。采用Q-Sepharose FF阴离子交换树脂和Phenyl-Sepharose FF疏水柱纯化,得目的蛋白纯度约为72%。纯化的样品行Western-Blot免疫印迹反应,结果显示在目的条带位置有明显反应带,说明纯化的目的蛋白cTnl可与cTnI抗体反应,有较好的免疫原性。用基因工程方法成功构建了重组cTnI蛋白原核表达体pET-28a-cTnI-BL21(DE3),此重组体系带有亲和性标签六聚组氨酸(6xHis),用镍亲和层析柱纯化cTnI-His,纯度达到98%,ELISA验证为阳性,可做为检测蛋白。用纯化的cTnI蛋白做为抗原免疫BALB/c小鼠,用高纯度的cTnI-His做为间接ELISA法检测蛋白,测小鼠免疫效价和筛选阳性克隆,把达到效价1：50000的小鼠脾脏和骨髓瘤细胞Sp2/0细胞融合,制备单克隆抗体。经过三次亚克隆和间接ELISA检测筛选到四株分泌cTnI的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,本实验分别命名为：B2-B4-F12、B2-D2-F6、B2-C2-A6、B2-G4-E7。挑取B2-D2-F6株采用体外细胞培养法大量制备单克隆抗体,行Protein A-Sepharose CL-4B亲和柱层析纯化,得到纯度90%的抗体,间接ELISA法测其效价1：5000。此抗体行Western-Blot免疫印迹反应,结果显示在抗原cTnI目的条带位置有明显反应带,说明纯化的cTnI单克隆抗体可与抗原cTnI反应,有较好的免疫原性,即得到了cTnI单克隆抗体。综上,成功构建重组cTnI的表达菌株,经过优化表达条件和相应纯化获得较高纯度的cTnI和His-cTnI,分别做为抗原和检测蛋白,并制得多株较好特异性的单克隆抗体。为cTnI临床免疫诊断试剂的研发和标准化奠定了基础。