蛋白质内含子是存在于前体蛋白中的一段内含肽,它通过蛋白质剪接反应将两端外显子通过天然肽键相连接。通过突变蛋白质内含子剪接过程中的保守氨基酸,剪接型的蛋白质内含子可转变为断裂型蛋白质原件。例如,将N端首位保守的Cys变成Ala后,蛋白质内含子就变成C端断裂元件。基于蛋白质内含子的剪接反应和突变后的断裂反应,蛋白质内含子在蛋白质工程中有着广泛的应用,例如在蛋白质纯化、分子开关、生物传感器、蛋白质标记等领域。本论文主要围绕蛋白质内含子在蛋白质纯化和生物传感器两个方面的应用展开相关研究。将断裂型的蛋白质内含子与蛋白纯化标签相融合,则可产生自我断裂蛋白质纯化标签。利用断裂型蛋白质内含子的自我断裂标签,迄今已有超过百余种蛋白成功得到纯化,使用的融合标签包括：常规的层析标签和新型的非层析标签。但基于蛋白质内含子的自我断裂标签在应用过程中还存在着诸多问题：蛋白质内含子的体内提前断裂和蛋白质内含子对目的蛋白的选择性就是这些问题中的比较突出的两个。基于不同的目的蛋白和表达环境,蛋白质内含子在细菌表达时的断裂效率一般在10-80%,而在高等哺乳动物细胞中基本没有完整的前体蛋白。另外,与蛋白质内含子剪接反应一样,蛋白质内含子的断裂反应对目的蛋白也有偏好性。例如Mtu RecA△I-CM对GFP蛋白就表现出比其它蛋白更低的断裂活性,在室温下25h后的断裂效率仅60%(与ELP标签融合)。这些瓶颈将会极大限制蛋白质内含子在蛋白质工程领域中的应用。为解决蛋白质内含子在体内发生提前断裂的难题,本论文采用了两种方法：断裂蛋白质内含子和Zn2+敏感型的蛋白质内含子。断裂蛋白质内含子由于其结构上的不完整性,导致功能丧失。但通过添加互补片段,断裂蛋白质内含子的结构和功能又可得到恢复。我们将△I-CM蛋白质内含子的剪接结构域分成两段,分别与一个非层析标签ELP相融合。不含蛋白质内含子N端的C端融合蛋白,由于结构上的不完整型,因此不具备C端断裂活性。在体外通过添加其互补的N端融合蛋白,蛋白质内含子的C端的前体蛋白则可恢复断裂活性。利用这一系统我们纯化了多个蛋白,且蛋白产量与全长蛋白质内含子系统相当或更高。同时,我们实验过程还发现通过一步法,即表达后的细胞在裂解之前混合并共同纯化,最终获得的蛋白产率明显高于标准的分步纯化法。第二种断裂型的蛋白质内含子是源于新型的S1型的Ssp DnaB蛋白质内含子。将缺少首11位氨基酸的Ssp DnaB蛋白质内含子引入到ELP-蛋白质内含子的非层析标签系统中。由于结构上的缺失,缺少前11位氨基酸的Ssp DnaB蛋白质内含子在体内不具有剪接活性。在体外通过添加化学合成的互补首11位氨基酸小肽,蛋白质内含子可恢复断裂活性。通过这种新型的断裂型蛋白质内含子系统,我们成功的制备了多种模式蛋白并对它们的活性进行了测试。在蛋白质内含子的晶体解析过程中,在靠近C端剪接区域发现一个Zn2+的结合区域。之后实验表明蛋白质内含子的剪接反应和N端断裂反应都可被Zn2+抑制,且Zn2+的抑制作用又可通过添加金属螯合剂消除,即可逆的。然而蛋白质内含子的C端断裂反应与剪接或N端断裂反应不完全相互依赖,Zn2+对蛋白质内含子C端断裂的抑制作用不如前两者明显。体外实验表明,这是由于参与蛋白质内含子的C端断裂的保守氨基酸与Zn2+的结合能力不够强的原因造成的。这里我们通过结构生物学的方法设计了多个金属离子Zn敏感型的C端断裂蛋白质内含子,并定性、定量分析了它们对Zn2+的敏感程度。实验通过在Mtu RecA AI-CM蛋白质内含子的N端引入突变并与蛋白质内含子中参与C端断裂反应的His439共同组成Zn2+结合区域,然后在体外测试Zn2+对C端断裂反应的抑制作用。这里共设计了6种不同的Zn2+敏感C端断裂型蛋白质内含子突变体(分别命名为001,002,003,003b,004和004b),然后将这些突变体引入到常见的蛋白质内含子活性评价模式蛋白MI-aFGF系统中,并对它们的Zn2+敏感性进行了筛选。研究发现在6个突变体中,突变体002由于体内断裂效率过高,以致体外无法获得未断裂前体,而另一突变体(001)在体内外均不具备断裂活性。在单剂量(1mM)实验中,Zn2+对剩于4个突变体以及野生型△I-CM的C端断裂抑制效率均可达80%左右,且这一抑制效应是可逆的。经半最大效应浓度(ECso)测试,发现003与野生型△I-CM对Zn离子敏感程度相当,004对Zn离子的敏感程度比野生型提高了1倍,而03b与04b对Zn离子的敏感程度5倍高于其野生型。除此之外,我Zn2+敏感型03b和04b突变体断裂速率也明显快于野生型。蛋白质内含子对目的蛋白的偏好性致使其对某些目的蛋白的断裂效率较低,而这也极大地限制了其在蛋白质纯化领域中的应用。我们通过对Mtu RecA△I-CM蛋白质内含子首位氨基酸进行20种氨基酸的突变,筛选得到一例以Gly为首位氨基酸的突变型(IG)蛋白质内含子。与野生型相比IG突变体更具通用性,且对温度也更加敏感。当与MBP标签相融合,在37℃下5小时内IG突变体基本可完成先前系统中断裂效率较慢的GFP断裂反应,而在同等条件下野生型的最终断裂断裂效率只有70%；在室温或更低温度条件下IG突变体与野生型断裂效率却相当。当与ELP标签相融合,这一差异更加明显。此外,我们还发现IG突变体在C端断裂过程会产生一个由其末位Asn与-1位Lys或-3位Lys形成的酰胺键。将目的蛋白质插入至蛋白质内含子内部,利用这一特殊的侧链反应我们还制备了蛋白质内含子与目的蛋白的融合环肽。通过这种方法制备的融合环肽同样具备其它环肽所具有的热稳定。经过100℃孵育半小时后,蛋白上清中仍有10%的融合环化蛋白。蛋白质内含子除了在蛋白质纯化中有着广泛的应用,蛋白质内含子对融合蛋白的结构还有稳定性的作用。基于此,我们前期构建了一系列的基于蛋白质内含子的核荷尔蒙激素微生物传感器,包括雌性激素(estrogen),甲状腺激素(thyroid)等。这种荷尔蒙微生物传感器是基于细菌生长表型,即只有当配体与其受体结合时,细菌才可产生生长表型信号,且生长信号的强弱与配体和配体结合域的结合能力呈正相关关系,反之细胞则不能生长。与其它常规核荷尔蒙检测系统相比,这种基于细菌生长表型的生物传感器有着许多优势,包括：使用成本低、高通量以及易于操作等。在这里我们利用之前构建的甲状腺激素微生物传感器,研究了6个临床发现的在甲状腺激素配体结合区域中引起耐甲状腺激素症(Resistance to thyroid hormone)的突变对甲状腺激素与受体结合的影响。研究表明,甲状腺激素微生物传感器不仅可以识别检测甲状腺激素化合物,同时还可以识别激素受体中的突变。这些突变在甲状腺激素与其受体结合过程中的作用是不等同的：有些突变会让配体结合域完全丧失配体结合能力,而另外一些则会让配体结合域部分丧失配体结合能力。通过测试它们的半最大效应浓度测试(EC50),我们定量分析了这些突变体对多个配体(包括天然与人工合成)与受体结合过程中影响状况,所得到的突变体对配体结合过程中的相对影响与许多其它系统中的得到的数据相一致。此外,我们还发现在这些突变体中的一个会使得配体结合域对拮抗剂更加敏感。综上所述,本研究论文优化了现有的基于蛋白质内含子的自我断裂标签系统,且利用含有蛋白质内含子的细菌传感器研究了人甲状腺激素受体中的突变对配体结合过程的影响。这些研究不仅从理论上为研究蛋白质内含子的断裂反应机理提供重要的参考价值,同时蛋白质内含子在蛋白质工程领域更广泛的应用奠定了坚实的基础。