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目的(1)将人肝癌细胞株HepG2与正常肝细胞进行三维培养,对比观察其能否形成血管生成拟态(Vasculogenic Mimicry,VM);并进一步探讨Cyclooxygenase-2(COX-2)和Matrix metalloproteinase-2(MMP-2)对三维培养中拟态血管形成的影响。(2)观察人肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)组织中是否存在血管生成拟态;检测COX-2,MMP-2在HCC中的表达,探讨COX-2,MMP-2与血管生成拟态以及肿瘤分化程度之间的关系。方法(1)应用三维细胞培养技术,建立肝癌细胞株HepG2的三维培养模型;同时三维培养正常肝细胞对其生成拟态血管的能力进行检测;在HepG2的三维培养模型中加入COX-2,MMP-2抗体进行抗体抑制,PAS染色以及免疫组化染色,观察拟态血管生成能力的变化。(2)收集人肝细胞肝癌标本31例存档石蜡包埋组织进行连续切片,HE染色观察;并应用免疫组织化学和PAS双重染色的方法检测肿瘤组织CD31,Ferritin的表达以及拟态血管的形成;运用免疫组织化学染色方法检测COX-2,MMP-2在肿瘤组织中的表达,进行统计学分析。结果(1)肝癌细胞三维培养两天时伸出细长突起,培养七天时癌细胞部分区域逐渐消失,剩余癌细胞彼此之间相互连接形成网络样、环状结构。而正常肝细胞在培养第一天可以见到个别细胞伸出细小突起,培养三天时细胞开始变圆变小,胞浆减少,胞核固缩,不能形成网环状结构。(2)抗体抑制实验中加入COX-2抗体的培养皿在培养三天后固定进行PAS染色,可见细胞伸出突起,有形成网络样结构的趋势,但所形成的网状结构没有未加抗体的HepG2三维培养明显;而加入MMP-2抗体的只有少数区域有形成网状结构的趋势,大部分区域细胞呈分散状态;加入COX-2,MMP-2两种抗体的基本上不能形成网环状结构,细胞分散生长。(3)免疫组化COX-2染色阳性强于MMP-2;加入COX-2抗体进行抗体抑制的细胞MMP-2染色阳性强度明显弱于未加抗体的细胞MMP-2染色。(4)31例人肝细胞肝癌标本中检测到VM的有22例。(5)COX-2蛋白在31例肝细胞肝癌中均有表达,有VM形成组COX-2阳性表达强度高于无VM形成组(P<0.05)。(6)MMP-2蛋白在30例肝细胞肝癌中有表达,有VM形成组MMP-2阳性表达强度高于无VM形成组(P<0.05)。(7)不同分化程度的肝细胞肝癌COX-2,MMP-2的表达差别有统计学意义(P<0.05)。(8)COX-2与MMP-2在肝细胞肝癌组织中的表达呈正相关。结论(1)体外培养人肝癌细胞HepG2具有形成拟态血管的能力。人正常肝细胞不具备形成拟态血管的能力。(2)COX-2在肿瘤细胞VM形成过程中发挥着重要的调节作用,抑制COX-2可以抑制肿瘤细胞拟态血管的形成。(3)COX-2能够通过上调MMP-2的表达抑制肿瘤细胞拟态血管的形成。(4)人肝细胞肝癌组织中有拟态血管生成。(5)MMP-2、COX-2在人肝细胞肝癌组织中过表达,COX-2的表达和肝细胞肝癌的拟态血管生成密切相关,MMP-2的表达强度与COX-2的表达强度正相关。(6)COX-2,MMP-2的表达强度与肝细胞肝癌的病理分级呈正相关。