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卵母细胞体外成熟及胚胎发育是发育生物学研究的基础,改善胚胎体外生产效率对提高动物生产及促进辅助生殖技术的应用具有重要意义。本文研究了白藜芦醇和褪黑素与卵母细胞体外成熟及胚胎发育的作用机制。结果如下：1.研究了不同浓度白藜芦醇(0.1,1.0或10μM)对牛卵母细胞成熟的影响及作用机制。研究显示,牛体外成熟培养液中添加适宜浓度白藜芦醇能显著增加卵丘细胞孕激素分泌及减少雌二醇的分泌。1.0μM白藜芦醇能显著促进卵丘扩展和极体形成,提高卵母细胞体外受精后囊胚率、孵化囊胚率和囊胚细胞数。白藜芦醇显著降低卵母细胞ROS水平,提高GSH水平。同时,本研究首次发现Sirt1在牛颗粒细胞、卵丘细胞、卵母细胞和囊胚中表达,且白藜芦醇能促进Sirtl的表达。本研究证明了白藜芦醇通过诱导孕激素分泌和抗氧化作用促进牛卵母细胞成熟及体外受精后胚胎发育,这种促进作用可能依赖于Sirtl途径。2.研究了不同浓度褪黑素(10-11,10-9,10-7,10-5,10-3M)对牛胚胎发育的影响及其作用机制。研究表明,前期培养液中添加10-7M褪黑素,后期培养液中添加10-9M褪黑素均能显著促进牛胚胎发育。qRT-PCR、免疫荧光和western blot检测表明,牛不同发育阶段胚胎上均存在MT1和MT2受体。进一步研究发现,褪黑素对牛胚胎发育的促进作用通过MT1受体介导。同时,褪黑素能显著影响牛胚胎发育过程中氧化、凋亡及发育相关重要基因(SLC2A1, DNMT1A和DSC2)的表达。本研究结果提供了褪黑素在体外条件下促进下牛胚胎发育的新机制。3.研究了褪黑素对体外发育胚胎质量的影响。本实验研究了褪黑素处理对体外发育囊胚玻璃化冷冻后死亡率、孵化率及发育相关基因表达的影响。研究表明,褪黑素(10-7M)组牛囊胚玻璃化冷冻并解冻培养24小时后囊胚孵化率显著高于对照组,而褪黑素组囊胚冷冻解冻后48至72h,囊胚死亡率显著低于对照组。此外,褪黑素组囊胚冷冻解冻后ⅠNMT3A,OCC,CDH1表达显著上调,AQP3的表达显著下调。综上所述,褪黑素不仅加快牛胚胎体外发育的速度及提高囊胚发育率,而且还通过提高抗冷冻能力及调控发育相关基因的表达而提高囊胚质量。4.研究了褪黑素对小鼠体外发育囊胚移植后附植效率的影响。研究显示,10-7M褪黑素能显著提高小鼠体外发育囊胚移植后的妊娠率(95.0%vs.67.8%),窝产仔数(4.1只/窝vs.2.7只/窝)和出生后代的存活率(96.84%vs.81.24%)。分子研究显示,褪黑素显著上调了超氧化物歧化酶(SOD)和抗凋亡基因bcl-2的表达,下调了促凋亡基因p53和caspase-3的表达。说明褪黑素通过减少ROS产生及抑制细胞凋亡而提高了囊胚质量,高质量的囊胚移植后能产生更多且更健康的后代。综上所述,白藜芦醇诱导牛卵母细胞孕激素分泌和降低胞内ROS水平、提高GSH水平,并可能通过Sirtl途径提高牛卵母细胞成熟及体外受精后发育效率；褪黑素通过降低胚胎发育过程中抗氧化抗凋亡基因(GPX4,SOD1和BCL-2)和发育相关重要基因(SLC2A1, DNMT1A和DSC2)的表达,下调促凋亡基因(P53,Bax和Caspase-3)表达,且通过MT1受体提高牛胚胎体外发育的效率和质量；通过上调DNMT3A、OCC、CDH1表达,下调AQP3表达,增强牛胚胎冷冻保存的抗冷冻能力；通过上调超氧化物歧化酶(SOD)和抗凋亡基因bcl-2表达,下调促凋亡基因p53和caspase-3表达,减少ROS产生及抑制细胞凋亡,显著提高小鼠囊胚移植后的附植和产仔成活效率。