研究目的:当今社会,人类生命和健康日益受到来自癌症的严重威胁。在我国城市居民的死因中,癌症在各种类型疾病的死亡率中占比达到25%。化学药物治疗可以通过药物进行全身范围内的治疗,因而成为临床上应用最广泛的治疗手段之一。而肿瘤多药耐药性是阻碍肿瘤化疗进程和预后的最严重的问题。临床数据统计表明,乳腺癌和宫颈癌是威胁女性健康的两大主要杀手,近年来这两种疾病的发病率和死亡率逐渐上升,并明显趋向年轻化。因此,如何有效的预防和治疗这两种癌症就成为重中之重。普朗尼克,是一类结构为聚氧乙烯(PEO)-聚氧丙烯(PPO)-聚氧乙烯(PEO)的三嵌段共聚物,可以于水溶液中利用本身携带的亲水端和疏水端自组装成胶束载体系统,近年来成为广大学者密切关注的热点问题。普朗尼克作为靶向递药系统的载体,其最大的不足在于它的临界胶束浓度比较低,因此在血液循环中容易被稀释,故而它易分解且不稳定,这就极大限制了单独采用普朗尼克作为载体在临床上的应用。如何克服普朗尼克胶束稀释后的不稳定性可?通过将普朗尼克与其它材料通过化学交联的方法制成稳定性胶束,提高胶束系统在临床治疗上的应用价值。紫杉醇是其中一种用来治疗乳腺癌和宫颈癌肿瘤细胞常用的化疗药物之一。但是它的长期治疗容易引起肿瘤细胞的耐药性,严重影响肿瘤的预后效果。研究发现,紫杉醇是多药耐药基因编码的P-gp糖蛋白的底物之一。但是紫杉醇具有强烈的疏水性能,在人体血液中,几乎无法溶解,使其在临床治疗中的应用受到很大的限制。临床上现在唯一可以得到的制剂即以聚氧乙烯蓖麻油为助溶剂,与无水乙醇按1:1体积比混合制成Taxol,但制剂中的聚氧乙烯蓖麻油会产生比较严重的毒副作用以及过敏反应。因此,如何将紫杉醇安全越过肿瘤的多药耐药性,并有效的发挥其作用,是科学家们一直努力解决的问题之一。透明质酸是一种大分子糖胺聚糖,是构成细胞外基质和细胞间质的主要成分。在合适的环境下,如在生理条件或适宜PH,HA分子中糖醛酸的羧基可以进行充分解离,并与正离子结合形成离子对。在机体内,HA通过与其受体CD44结合,并利用本身的黏性及高度水合性来发挥其重要作用。CD44是迄今发现的HA四种受体之一,既是一种黏附分子,也是一组跨膜糖蛋白,功能和结构很复杂,宫颈癌和乳腺癌的肿瘤细胞表面广泛存在,与肿瘤的某些生物学特性如生长、浸润、转移密切相关。本课题利用高分子材料-普朗尼克,制备一种纳米给药系统,不但在体内循环系统中可以稳定存在、耐稀释,同时能主动将化疗药物靶向细胞内的。通过化学交联的方法,将普朗尼克P85与DSPE交联,形成稳定的固体脂质纳米粒;利用透明质酸可特异结合肿瘤细胞表明CD44的特点,在纳米粒表面连接上透明质酸,制备靶向递药载体;通过细胞实验和动物实验验证所制备的纳米靶向给药系统对耐药肿瘤细胞的细胞毒性作用以及在体内的抗肿瘤效果。研究方法:1.普朗尼克P85-DSPE的合成实验通过化学合成的方法,将普朗尼克P85与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoyl phosphoethanolamine,DSPE)在 1,10-羰基二咪唑(1,10-carbonyldiimidazole,CDI)的催化作用下偶联合成 P85-DSPE。2.固体脂质纳米粒SLN的制备通过热乳匀法和正负电子力相互作用来制备固体脂质纳米粒。首先,将GMS,P85-DSPE(5:1,w/w)和紫杉醇PTX在70度热乙醇中融化、溶解以形成脂相。另外,通过在纯水中溶解DOTAP(0.2%,w/v)和Poloxamer 188(0.1%,w/v)形成水相,同时加热到与脂相相同的温度。然后将脂相逐滴加入到水相中。温和搅拌混合物10分钟,用高压乳匀机循环乳匀3-5次,持续搅拌直到溶剂完全蒸发,即得 PTX-P85-SLN。而HA-PTX-P85-SLN的制备是将1ml PTX-P85-SLN纳米分散剂逐滴加到透明质酸HA(0.03%,w/v)中,并且不断温柔搅拌。30分钟后,在HA和SLN之间形成的正负电子力促使形成HA-PTX-P85-SLN。3.固体脂质纳米粒SLN稳定性的鉴定通过平均直径、zeta电势、表型、药物包封率、药物装载能力和体外药物释放实验来评价制备的PTX装载的SLN的物理性质。利用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments,UK)进行动态光散射来测定SLN的载体大小和电势。通过高效液相色谱法测定SLN的药物包封率(EE)和药物装载能力(LC)。同时通过透析的方法测定从SLN释放出来的PTX的数量。4.HA-PTX-P85-SLN对乳腺癌和宫颈癌肿瘤细胞的作用通过流式细胞分析检测肿瘤细胞对HA-PTX-P85-SLN的摄取能力。通过MTT法来检测HA-PTX-P85-SLN对肿瘤细胞的毒性。同时,在健康的雌性BALB/c 小鼠中建立Hela/PTX肿瘤模型。将肿瘤模型小鼠随机分成5组,生理盐水对照组、游离PTX处理组,PTX-SLN处理组,PTX-P85-SLN处理组,HA-PTX-P85-SLN处理组。以10mg PTX/kg的剂量隔天尾静脉注射。同时,测量肿瘤的体积和小鼠重量。收集不同时间点采集的血液样本,进行药物动力学分析。同时,收集药物处理24小时后小鼠的各个脏器和肿瘤组织,进行生物分布检测。研究结果:结果发现,我们制备的HA-PTX-P85-SLN复合物,于透射电子显微镜下进行观察,显示不仅分散性好,圆整并且均匀而不粘连。其平均粒径为160.3nm,具有负的zeta电势(-31.6mv),药物包封率为88.2%,药物装载能力为4.9%。与游离PTX相比,HA-PTX-P85-SLN递药载体表现出较长的药物释放时间,在其前期药物释放阶段速度很快,即快速释药,进入后期转为缓慢释药阶段。这种释放药物的特点与抗肿瘤药物的用药原则是相一致的,即在到达靶向部位后,纳米粒快速释放出较多药物,以较高药物浓度达到治疗作用,进入后期则将剩余药物缓慢释放,可使药物得以在到达靶部位后维持较高的有效药物浓度,从而将治疗作用维持时间有效延长。HA-PTX-P85-SLN的细胞摄取效率大大超过其它SLNs(p<0.05);HA-PTX-P85-SLN对Hela/PTX细胞的细胞毒性大大超过其它SLNs(IC50值为0.2 nmol/ml);HA-PTX-P85-SLN处理组小鼠的肿瘤生长率维持较低的水平,具有显著抑制肿瘤生长的能力,且不会造成处理组小鼠的体重降低。药物动力学分析结果表明,游离的PTX在3小时内迅速的从血清中消失,而PTX装载的SLN则表现出缓慢的降低(持续到24小时才完全消失)。游离PTX和 HA-PTX-P85-SLN 的半衰期(t1/2β)分别为 2.23±0.09 h 和 13.12±0.82 h、平均停留时间(MRT)分别为1.26±0.52 h和8.17±0.85 h、机体清除率(CL)分别为0.71±0.06 L/h/kg和0.17±0.01 L/h/kg以及血清浓度与时间曲线面积(AUC0～∞)分别为 12.89±2.37μg*h/mL 和 59.33±6.39 μg*h/mL。结果证明:HA-PTX-P85-SLN 纳米粒经静脉途径注射给药后,药物在体内的滞留时间不但可显著延长,同时由于将药物缓慢释放,使药物可以发挥长效作用。由小鼠体内组织分布试验表明,HA-PTX-P85-SLN经尾静脉注射后,药物在各组织器官的分布发生了改变。结果显示,HA-PTX-P85-SLN和PTX-P85-SLN或游离PTX相比,在肿瘤组织中的药物浓度分别增加了 5.5倍和4.1倍。另外,PTX装载的SLN在肝脏和肺脏中的药物浓度高于游离的PTX,而它们在心脏和肾脏中的药物浓度要显著性低于游离的PTX(p<0.05),说明将药物制成纳米粒后具有明显的肝、肺靶向性。结论和创新性:综上所述,本研究表明透明质酸装饰普朗尼克P85固体脂质纳米粒对宫颈癌和乳腺癌肿瘤细胞具有更强的细胞毒性,以及对抗宫颈癌和乳腺癌肿瘤多药耐药性的能力。与游离的PTX相比,HA-PTX-P85-SLN表现出增强的对耐药肿瘤细胞的细胞毒性,并且表现为剂量依赖效应。这可能是增强的靶向传递PTX到肿瘤细胞的效果。有许多因素都能影响细胞内增加的PTX浓度:如SLN的EPR、化疗剂P85、以及活化的靶受体的配体HA。研究报道,P85能够通过抑制肿瘤细胞对药物的外排作用,降低肿瘤细胞的MDR。而HA装饰的纳米质粒可以将化疗剂靶向传递到肿瘤细胞中,从而降低有效药物使用的剂量来克服MDR。通过分别比较游离的PTX以及PTX装载的SLN对Hela/PTX和Hela、MCF-7/PTX和MCF-7细胞的毒性实验,进一步表明肿瘤对HA装饰的P85包被的SLN能够客服肿瘤耐药细胞的MDR,实现更好的肿瘤耐药细胞的靶向治疗。为了确定PTX装载的SLN能够更加安全有效的到达肿瘤组织,我们分析了肿瘤小鼠处理组的肿瘤大小和体重情况。已有的研究报道,HA装饰的脂质纳米质粒能够延长药物在血清中的循环时间并且可以增加药物在肿瘤组织中的累积,从而具有更强的体内抗肿瘤能力。我们的研究结果发现,与游离的PTX相比,PTX-P85-SLN和HA-PTX-P85-SLN都表现出显著的肿瘤生长抑制能力。进一步的补充证明将HA的靶向能力和P85的抗肿瘤能力相结合的优势。这些结果与先前的体外细胞毒性实验相一致,都提示了 HA-P85-SLN可以成为治疗MDR肿瘤细胞的新的工具。药物动力学和生物分布更进一步的说明与PTX-P85-SLN相比,HA-PTX-P85-SLN具有最大的AUC,MRT和肿瘤组织药物浓度值(p<0.05)。在肾脏和心脏中检测到降低的PTX装载的SLN药物浓度表明用PTX装载的SLN治疗肿瘤,其毒副作用也是大大降低的,且更具有显著的靶向性。因此,我们制备的HA-PTX-P85-SLN可作为宫颈癌和乳腺癌治疗的潜在的靶向递药载体,为肿瘤耐药细胞的靶向治疗提供新的研究思路。研究目的随着检测技术的不断进步,恶性肿瘤的检出比例显著提高,同时肿瘤发病年龄趋于年轻化,发病于绝经期前或围绝经期的病例所占比例显著上升。通过手术尽可能切除患癌组织并辅以放、化疗,致雌激素水平迅速下降,绝经症状提前出现,严重影响患者的身心健康,并降低患者治疗的信心。激素替代治疗(HRT)是缓解绝经相关症状的有效方案。其作用也是其他药物无法替代的,然而对于HRT利弊的争论,从未停止,一直是医学专家们研究的焦点。虽然HRT是治疗绝经综合征相关症状的首选治疗手段,但越来越多的患者开始担心应用HRT可能会带来的副作用。目前妇科恶性肿瘤术后采用HRT也存在争议,因此对于专科医生而言,更应以严谨的态度对待HRT在妇科肿瘤术后病人中的应用。由于传统上对激素类药物的恐惧心理,HRT应用在我国并不普及。他们更愿意去寻求其他的天然药物和方法来缓解绝经相关症状。传统中药治疗绝经综合征在我国由来已久,也颇有疗效。从发表文献来看,坤泰胶囊被医生用于更年期相关疾病,卵巢早衰等疾病,且收到很好的疗效。但对那些发病于绝经期前或围绝经期的妇科恶性肿瘤患者,接受了肿瘤根治术并切除了双侧卵巢,或辅以放化疗的过程中出现绝经综合征相关症状,应用坤泰胶囊是否亦存在很好的疗效未有详细的研究,因此,将中成药坤泰胶囊应用于妇科恶性肿瘤患者术后绝经综合征相关症状的治疗,并对其疗效进行观察和分析,为这类患者的临床治疗提供一个新的研究方向,以期找到更加安全可靠有效的HT替代治疗药物,提高肿瘤患者术后生存质量,具有重要临床意义。本研究通过监测口服坤泰胶囊后患者血清中FSH、E2水平的变化,KMI症状评分的改变,研究坤泰胶囊对妇科恶性肿瘤患者绝经综合征症状改善的临床应用价值。研究方法1.一般资料所有病例均来源于2014年7至2016年1月,山东省立医院妇科,发病于绝经期前或围绝经期的妇科恶性肿瘤患者,接受了肿瘤根治术并切除了双侧卵巢,或辅以放化疗的过程中出现绝经综合征相关症状,120例,按随机数字表法分为实验组和对照组,每组各60例。2.病例入选标准妇科恶性肿瘤患者发病于绝经期前或围绝经期,接受过放疗/化疗/双侧卵巢切除手术,并出现绝经综合征的妇女,年龄20-45岁。(1)血管舒缩症状,主要表现为潮热、盗汗;(2)自主神经失调症状,如心悸、眩晕、头痛、失眠、耳鸣等;(3)神经精神症状,注意力不集中、情绪波动大、激动易怒、情绪低落、抑郁、不能自我控制、记忆力减退等症状。3.排除标准:(1)不符合纳入标准;(2)合并有严重的心脑血管、肝、肾和造血系统等疾病及精神病患者;(3)合并乳腺肿瘤的患者;(4)过敏体质或对坤泰胶囊组成成分过敏者,(5)随访中无法判断疗效或随访资料不全影响疗效判断的患者。(6)近3个月内,使用过含有性激素的药物或营养品。4.治疗方法实验组:饭后一个半小时口服坤泰胶囊,4粒/次,3次/天,连续服用12周。对照组:饭后一个半小时口服坤泰胶囊安慰剂,4粒/次,3次/天,连续服用12周。随访12周,三次随访时间分别是初诊及治疗后第4、12周。5.观察指标与方法5.1安全性指标患者用药前、连续服药第4周,第12周,进行安全性监测项目。5.1.1 一般体检项目:心率、血压5.1.2血、尿、便常规检测5.1.3心电图、肝功能(ALT)、肾功能(Cr,BUN)检查5.2疗效评价指标5.2.1采用改良的Kupperman绝经指数评分(KMI)评分内容包括潮热出汗、感觉异常(耳鸣、麻木、刺痛)、失眠、情绪波动、抑郁、头晕、疲乏、骨关节痛、头痛、心悸、皮肤蚁走感,泌尿系感染及性生活等共13项。每种症状分按无、轻、中、重程度分别为0、1、2.3分。症状指数是恒定的,潮热出汗为4,感觉异常、失眠、易激动、性交痛为3,泌尿系统症状为2,其余是1,单项评分=症状程度分×症状指数(加权分),总分为每个单项评分的总和。评分越高症状越明显。5.2.2血清雌二醇(E2)及促卵泡激素水平(FSH)水平实验组与对照组患者均于用药前、连续用药第4周,第12周清晨空腹采集静脉血2毫升,2h内分离出血清,保存于--70℃冰箱,电化学发光法检测标本中的E2,FSH水平。6.统计学方法采用SPSS11.0和SAS9.2软件进行统计分析。其中,计数资料用卡方检验;计量资料用t检验,两组样本进行均数比较时采用独立样本t检验,服用药物前后的比较则使用配对样本t检验,P>0.05为无显著性差异,P<0.05有显著性差异,有统计学意义。结论1.坤泰胶囊在妇科恶性肿瘤患者伴随绝经症状时,持续用药时间与药物临床疗效具有相关性,服药第12周患者血清性激素FSH显著下降,E2明显上升。2.坤泰胶囊在治疗第4周,患者感觉异常、失眠、心悸、头晕症状显著改善,第12周时潮热出汗明显好转。3.口服坤泰胶囊,可以作为恶性肿瘤患者激素治疗的替代治疗方式,改善绝经综合征症状同时提高生存质量。讨论妇科恶性肿瘤患者,发病于绝经期前或围绝经期者,在接受手术治疗切除了卵巢,或接受放化疗之后,绝经症状出现的更早,并且程度更剧烈。目前公认,HRT治疗可以有效缓解绝经症状。然而,恶性肿瘤患者是否可以安全的使用HRT则存在较大争议,所以越来越多的患者倾向于选择中药进行治疗。从中医学理论认为,坤泰胶囊由熟地黄、黄连、白芍、黄芩、阿胶、茯苓组成,六味药合用组方,共同起到了滋阴清热、安神除烦之功效。滋阴养血,益精填髓,清心除烦,调节阴阳平衡。张邵芬认为坤泰胶囊可以使卵巢体积增大,黄体数增加,改善更年期大鼠的卵巢功能。研究显示,坤泰胶囊可以提高患者血清E2水平及阴道细胞成熟程度,降低血清FSH水平,治疗12周后KMI症状评分亦显著改善,这与付苍玲的研究结果显示的用药第4周及8周,坤泰胶囊疗效不显著是相一致的。本研究中坤泰胶囊治疗的第4及第12周,患者中未见明显毒副作用。坤泰胶囊口服方便,不良反应少,可以作为恶性肿瘤患者HT的替代治疗方式,改善绝经症状。