燕麦矮缩病毒(Oat dwarf virus，ODV)是双生病毒科玉米线条病毒属的一个典型成员，其编码的RepA蛋白是一个诱导植物过敏性反应(HR)的效应子。前期研究以ODV的RepA作为诱饵蛋白，通过酵母双杂交系统从本氏烟的cDNA文库中筛选到NbRFP是与RepA互作的候选互作因子之一。为了深入解析RepA诱导HR反应的分子机理，本研究对NbRFP和RepA的互作进一步进行了体内和体外验证，并探讨了这种互作调控RepA诱导HR的分子机制。　　从本氏烟中克隆了NbRFP蛋白的全长cDNA序列，序列比对结果显示其与普通烟上分离到的NtRFP蛋白的氨基酸序列同源性高达97％，而NtRFP已被证明是一个典型的RING型的E3泛素连接酶。利用qRT-PCR进行NbRFP蛋白的组织特异性检测，发现其于花期之前在根和叶中表达量较高，而在花期则在根和花中表达量较高。进一步利用激光共聚焦显微镜观察NbRFP蛋白的亚细胞定位，发现其定位于烟草表皮细胞的细胞核和细胞质中。　　为了验证NbRFP和RepA的互作，将NbRFP的全长cDNA构建到pGADT7载体上，并将RepA构建到pGBKT7载体上，通过酵母双杂交实验证实NbRFP与RepA蛋白存在体外互作。同时，通过双分子荧光互补试验也证实NbRFP与RepA蛋白能够在烟草表皮细胞中相互作用，并且互作主要发生在细胞质和细胞核中。进一步又将NbRFP和RepA分别构建于带GFP标签的pBA-GFP载体和带Flag的pBA-Flag载体，通过免疫共沉淀实验证实NbRFP和RepA蛋白在烟草细胞内互作。　　为了验证NbRFP和RepA互作的生物学意义，利用TRV介导的VIGS系统沉默本氏烟内源的NbRFP并引起其表达水平下调，在NbRFP沉默植株中瞬时表达RepA，与内源NbRFP未沉默的对照植株相比，发现RepA诱导HR发生了明显的延迟。与此同时，发现RepA诱导HR在过表达NbRFP的转基因本氏烟植株中相较于野生型植株有明显的提前。但是，Western blot分析显示过表达或沉默NbRFP并不影响RepA蛋白的表达水平，这表明NbRFP并不是通过影响RepA蛋白的积累量来调控RepA诱导HR。　　通过InterProScan在线软件对NbRFP蛋白的保守结构域进行预测，结果显示NbRFP蛋白含有VWA和RING两个保守的功能结构域。构建NbRFP不同结构域缺失的突变体，通过双分子荧光互补试验分析其与RepA蛋白的互作情况，结果表明RING finger domain对于NbRFP与RepA互作是必须的。将NbRFP不同结构域缺失的突变体和RepA进行瞬时共表达，发现RING finger domain缺失的NbRFP突变体不再能够对RepA诱导HR起调控作用，证实RING finger domain是NbRFP参与调控RepA诱导HR的关键元件。　　为了进一步解析寄主因子NbRFP调控RepA诱导HR的分子机制，在NbRFP过表达转基因本氏烟与野生型本氏烟叶片中分别瞬时表达RepA，在接种后18h和36h分别开展基因表达谱测序。表达谱测序结果显示18 h样品中有22个基因显著上调，15个基因显著下调。36h样品中有384个基因显著上调，有232个基因显著下调。这些显著差异基因在蛋白酶体降解途径、植物-病原物互作途径、泛素介导的蛋白质降解途径、自噬途径、植物激素信号途径等Pathway上富集。值得关注的是，过表达NbRFP使JAZ基因表达水平显著下调，推测NbRFP可能通过影响JAZ的稳定性参与JA信号途径调控RepA诱导HR。