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第一部分 HOXA9/HOXB9对神经母细胞瘤细胞周期的作用目的:研究HOXA9、HOXB9的表达对人神经母细胞瘤细胞系BE(2)-C细胞生长周期调控的作用。方法:使用逆转录病毒转染法构建HOXA9、HOXB9的tet-off诱导表达系统,撤去多西环素(Doxycycline,Doxy)后用倒置相差显微镜观察细胞生长密度,用PI流式细胞仪检测对BE(2)-C细胞周期的影响,并用Western Blot法检测细胞周期调控相关蛋白CyclinA2、CyclinB1、CDK1蛋白表达水平的变化。结果:1.使用逆转录病毒转染法使含有HOXA9或HOXB9的Doxy诱导表达载体整合到BE(2)-C细胞中,在含有Doxy的细胞培养基中培养时,细胞都不表达HOXA9或HOXB9,当撤去Doxy 3天后,细胞开始诱导表达HOXA9或HOXB9,其表达随Doxy撤去不同时间出现时间依赖性的逐渐诱导性高表达。2.Doxy从诱导性表达HOXA9或HOXB9的BE(2)-C细胞培养体系中撤去,通过倒置相差显微镜观察细胞生长密度,结果显示Doxy从BE(2)-C细胞培养体系中撤去导致BE(2)-C细胞的HOXA9或HOXB9高表达体系中均出现细胞生长密度明显变小,生长明显缓慢,并发生形态学改变。3.Doxy从诱导性表达HOXA9或HOXB9的BE(2)-C细胞培养体系中撤去,通过PI染色流式细胞仪检测BE(2)-C细胞周期,结果显示Doxy从BE(2)-C细胞培养体系中撤去导致HOXA9高表达后细胞周期G1期百分比从对照组的68.7%升高到85.8%(p<0.05);Doxy从BE(2)-C细胞培养体系中撤去导致HOXB9高表达后细胞周期G1期百分比从对照组的73.5%升高到90.9%(p<0.05)。4.Doxy从HOXA9或HOXB9诱导表达的BE(2)-C细胞培养体系中撤去3天、6天、9天后,用Western Blot法检测细胞周期调控相关蛋白CyclinA2、CyclinB1、CDK1蛋白表达水平的变化。结果表明,HOXA9或HOXB9随Doxy撤去不同时间出现时间依赖性逐渐诱导性高表达,在Doxy撤去9天时HOXA9或HOXB9表达水平出现高峰,同时细胞周期调控相关蛋白CyclinA2、CyclinB1、CDk1蛋白水平在Doxy撤去不同时间点呈现时间依赖性逐渐降低。结论:1.Tet-off诱导性基因表达系统是研究HOX基因家族对细胞命运调控功能理想的表达工具体系,为肿瘤基因治疗提供的一条可控的安全途径和研究工具。2.高表达的HOXA9和HOXB9可通过下调细胞周期调控相关蛋白CyclinA2、CyclinB1及CDK1的表达而诱导人神经母细胞瘤细胞系BE(2)-C细胞生长发生G1期阻滞,从而抑制肿瘤细胞增殖。3.HOXA9与HOXB9对人神经母细胞瘤系BE(2)-C细胞的细胞周期调控的方向一致,具有功能的相似性,在神经母细胞瘤中作为一种抑癌因子。第二部分 HOXA9/HOXB9对神经母细胞瘤细胞分化的作用目的:研究HOXA9、HOXB9的诱导表达对人神经母细胞瘤细胞系BE(2)-C细胞分化的作用。方法:构建HOXA9、HOXB9的tet-off诱导表达系统,撤去Doxy后倒置相差显微镜观察BE(2)-C细胞形态,用免疫荧光化学染色方法检测细胞的形态改变及Peripherin、Vimentin 和 NEFM 表达的变化,并用 Western Blot 法检测 PHOX2B、NEFM蛋白表达水平的变化。结果:1.Doxy从诱导性表达HOXA9或HOXB9的BE(2)-C细胞培养体系中撤去,通过倒置相差显微镜观察细胞形态,结果显示Doxy从BE(2)-C细胞培养体系中撤去导致BE(2)-C细胞的HOXA9或HOXB9高表达体系中均出现细胞形态改变,胞体变细,并生长出较长突起,类似于神经元样细胞形态改变;同时发现细胞变少,生长变慢。2.免疫荧光化学染色显示随着Doxy从HOXA9或HOXB9诱导表达BE(2)-C细胞培养体系中撤去,HOXA9或HOXB9得到诱导性高表达后,细胞增殖因子KI67的表达明显下降,伴随细胞形态改变,出现多而长的神经丝样突起,同时细胞内向N型细胞分化的特异性标志蛋白Peripherin表达明显增高、神经元标志物NEFM表达上调,而S型细胞方向分化的特异性标志蛋白Vimentin表达水平下调。3.Western Blot法检测蛋白水平表现为随着Doxy从HOXA9或HOXB9诱导表达BE(2)-C细胞培养体系中撤去,HOXA9或HOXB9得到诱导性高表达后,细胞神经母细胞瘤未分化状态相关标记物PHOX2B表达水平明显下降,而神经元标志物NEFM的表达上调。结论:1.高表达的HOXA9和HOXB9促使人神经母细胞瘤细胞系BE(2)-C细胞表达细胞增殖因子Ki67明显下调,提示高表达的HOXA9和HOXB9抑制肿瘤细胞生长。2.高表达的HOXA9或HOXB9可诱导人神经母细胞瘤系BE(2)-C细胞明显高表达N型细胞标志物Peripherin,并伴随未分化标志物PHOX2B表达下调及神经元细胞标志分子NEFM的表达上调,提示向N型细胞分化,并进一步促使向神经元方向分化。3.HOXA9与HOXB9对神经母细胞瘤系BE(2)-C细胞的生长和分化调控的方向一致,具有功能的相似性,在神经母细胞瘤中作为一种抑癌因子。