肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是成人运动神经元病最常见的类型,由Charcot于1869年首先描述。ALS与其他运动神经元病的区别是上运动神经元和下运动神经元均发生变性。ALS主要的神经病理特征包括脊髓前角及脑干运动神经元广泛损失、皮质脊髓束变性和初级运动皮质大锥体神经元变性及损失。ALS的患病率约为5-7/10万,大多数ALS病例为散发性(sALS),5-10%为家族性(fALS)。无论患者是散发性还是家族性,均会发生进行性肌肉无力和肌肉萎缩。进行性肌肉无力可始于上肢或下肢的近端或远端,并可累及所有肌肉,包括与呼吸、言语及吞咽有关的肌肉。多数患者在被诊断2-5年后,死于呼吸衰竭。在疾病早期,下运动神经元和上运动神经元受累的不同模式使ALS的诊断面临挑战。由于ALS最初症状与其他脊髓疾病、周围神经病变及神经综合征相似,因而诊断延迟是其主要问题之一。由于缺乏特异的疾病标志,ALS临床诊断标准的建立基于下运动神经元和上运动神经元病变的存在及分布,并且需要使用排除过程来确定诊断。实验室检查、神经影像和肌肉活检都可能有助于鉴别诊断和排除与ALS类似的疾病过程,而一旦其他疾病过程被排除,电生理评估是确立ALS诊断的关键。并且,电生理评价不仅在疾病诊断中有用,而且有助于监测疾病的进展和对干预的反应,有助于确定预后。因此,目前ALS诊断主要依靠临床表现与神经电生理检查相结合。目前被识别的引起ALS的基因突变超过20种,其中最常见的突变发生于SOD1、RNA结合蛋白编码基因TARDBP、FUS,以及最近所认识C9orf72基因。2011年,C9orf72基因非编码区六核苷酸GGGGCC的致病性重复扩增现象在ALS和额颞叶痴呆患者中被发现并报道。通过对9p21位点上风险单倍型的研究认识到C9orf72基因中GGGGCC扩增。应用重复引物聚合酶链反应的测序,最终认为至少30次的重复扩增与ALS有关。与非C9orf72 ALS病例相比,C9orf72相关性ALS有其临床特征,伴发额颞叶痴呆的比例明显增高,容易出现认知功能障碍和精神行为异常,延髓起病的比例增高,发病年龄提前1.8-5.0年,运动症状恶化速度快,病程缩短5.7-12.0月,显示了其更强的疾病进程。同时,C9orf72疾病谱还包括原发性侧索硬化、进行性肌萎缩、帕金森综合征/帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病等。由于携带C9orf72基因突变的患者数量众多,并且C9orf72相关疾病谱非常广泛,其介导的ALS是多方面且复杂的,近年来C9orf72基因逐渐成为研究热点。核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是淋巴细胞中的一种诱导型转录因子,对身体中几乎所有细胞类型都产生影响,在炎症、免疫反应、细胞周期和细胞存活中起重要作用。在中枢神经系统,NF-κB转录因子是神经发生、神经突生成及突触可塑性等许多生理过程的关键参与者。NF-κB为组成型活性,参与神经元细胞体中的神经元损伤以及神经保护。NF-1κB在突触中以潜在形式存在,只有当其被激活时,才能被运输到神经元细胞核。免疫组化证实,NF-κB可在家族和散发ALS患者的神经胶质中被活化。研究表明,SOD1-G93A小胶质细胞在NF-κB依赖性机制中在体内及体外均可诱导运动神经元死亡。第一部分肌萎缩侧索硬化的临床及电生理特点分析目的:通过分析ALS临床及电生理资料,为临床医生提供本病较为直观和深入的认识,使患者尽可能得到早期诊断,从而获得正确的治疗,以期患者的生存期得以延长,生活质量得以提高。方法:收集2009年1月至2016年6月在我院神经内科就诊的73例患者,符合E1 Escorial修订版诊断标准,诊断分级为临床确诊及临床拟诊。进行详尽的病史询问及神经查体,收集患者的发病年龄、起病部位、累及部位、主要的症状及体征,进行运动传导速度(motor conduction velocity,MCV)测定、感觉传导速度(sensory conduction velocity,SCV)测定、重复神经刺激(repetitive nerve stimulation,RNS)、针电极肌电图(EMG)等电生理检查,回顾性分析、总结ALS的临床及电生理特点。结果:患者共73例,其中男42例(57.5%),女性31例(42.5%),男女比例为1.4:1。发病年龄28.1-78.8岁,平均发病年龄(51.7±12.4)岁。发病年龄高峰为51-60岁。起病部位比率最高的颈段为56.2%,其次为腰骶段(24.6%)和延髓段(19.2%)。常见的下运动神经元症状及体征中肌肉无力(97.3%)和肌肉萎缩(76.7%)最常见。运动神经传导总的异常率为45.9%,但运动传导的远端潜伏期、波幅及传导速度的平均值均在正常范围。复合肌肉动作电位(compound muscle action potential,CMAP)波幅值与截断值的比值,正中神经平均值为(1.06±0.74),尺神经平均值为(1.49±0.81),尺神经明显大于正中神经(P=0.000)。感觉神经传导总的异常率为2.3%,但感觉传导的波幅及传导速度的平均值均在正常范围。重复神经刺激,拇短展肌(正中神经支配)和小指展肌(尺神经支配)记录的CMAP波幅递减的平均值分别为(9.07%±8.68%)和(2.89%±2.47%),拇短展肌的递减幅度明显大于小指展肌(P=0.000)。在正中神经,CMAP递减和CMAP的波幅呈负相关(R=-0.357,P=0.000),而在尺神经,没有观察到相关性(P=0.223)。针电极EMG显示,舌肌总的自发电位及纤颤/正尖波、束颤电位的出现率(分别为 79.1%、65.1%、58.1%)均比胸锁乳突肌(分别为 48.8%、30.2%、32.6%)高(P值分别为0.004,0.001,0.017)。具有延髓症状和仅具肢体症状的患者,其舌肌自发电位的出现率分别为84.2%和75.0%,二者相比无统计学差异(P=0.708)。结论:ALS发病男性多于女性,好发于中老年人,发病高峰为51-60岁。起病部位以颈段最多,其次为腰骶段、延髓段。下运动神经元症状以肌肉无力最多见,其次为肌肉萎缩。部分患者会出现运动传导异常,以CMAP波幅下降最为多见。感觉传导异常少见,说明本病对感觉传导通路影响不大;如果出现异常,并不能完全排除本病,应注意排除伴随的其他周围神经病。RNS检查表明,正中神经比尺神经CMAP波幅递减的幅度大,其原因是在ALS的病理生理中正中神经较尺神经优先受累。CMAP递减可能由新芽生的神经末梢传导不稳定引起。在评估舌肌的临床和亚临床受累方面,无论是延髓起病还是肢体起病的ALS,舌肌针电极EMG均是一种有价值的电生理方法,但应注意操作方法。第二部分ALS突变基因C9orf72细胞模型的生物学功能分析及其机制的研究目的:构建C9orf72诱导的ALS细胞模型并对其进行生物学功能分析;检测C9orf72是否通过NF-κB信号通路造成神经元损伤。方法:利用化学合成方法,体外获得C9orf72的突变基因,然后构建基因的真核表达载体;应用阳离子脂质体转染法,将上述构建成功的真核表达载体转染到NSC-34细胞中,使用RT-PCR和Western blots方法,分别在转录组与蛋白质组进行检测,确认细胞模型构建成功;使用免疫细胞化学方法,进行神经元细胞的形态学检测;使用丙二醛(MDA)方法,检测细胞氧化应激情况;实验组与对照组,应用RT-PCR和Western blots方法,进行NF-κB信号通路活性检测;将siRNA-NF-κB转染到NSC-34细胞中,应用Western blots方法,研究NF-κB信号通路中,实验组与对照组的上下游蛋白分子变化,根据变化情况去阐明C9orf72诱导的ALS发生的分子机制。结果:获得转染 pcDNA3.1(+)-(CATCATCACCATCACCAT)(GGGGCC)30 成功的细胞模型。免疫细胞化学检测发现,与对照组相比,转染pcDNA3.1(+)-(CATCATCACCATCACCAT)(GGGGCC)30 后,胞体明显变圆,突起减少,且轴突变短。MDA结果显示,转染组为(2.92±0.14)nmol/mgprot,正常组为(1.63±0.12)nmol/mgprot,空载组为(1.82±0.21)nmol/mgprot,转染组细胞内MDA的含量明显高于其他两组(P<0.05)。转染pcDNA3.1(+)-(CATCATCACCATCACCAT)(GGGGCC)30 24 小时后,以正常细胞组和转染pcDNA3.1(+)组作为对照组,与对照组相比较,转染组中细胞内的P-NF-κB蛋白表达明显升高(P<0.05)。转染siRNA-NF-κB 24小时后,与siRNA转染组相比较,siRNA-NF-KB转染组中细胞内的NF-κB表达受到明显的抑制(P<0.05);但是C9orf72蛋白的表达无变化。正常组、空载体组、pcDNA3.1(+)-(CATCATCACCATCACCAT)(GGGGCC)30 转染组与 siRNA-NF-κB转染组的 MDA 含量分别为(1.72±0.22)nmol/mgprot、(1.86±0.37)nmol/mgprot、(3.12±0.28)nmol/mgprot、(1.75±0.18)nmol/mgprot。统计学分析显示,pcDNA3.1(+)-(CATCATCACCATCACCAT)(GGGGCC)30 转染组细胞内的 MDA含量明显高于其他三组细胞(P<0.05),而siRNA-NF-KB转染组的MDA含量与正常组和空载体组相比没有明显差异(P>0.05)。结论:本研究成功构建了 C9orf72诱导的ALS细胞模型。C9orf72基因中30次重复的GGGGCC对神经元样细胞存在毒性损伤作用。C9orf72通过下游NF-κB信号通路导致神经元损伤。