目的：　　本课题我们以癌细胞的较为独特的能量代谢方式，即糖酵解代谢为研究切入点，首先通过oncomine数据库分析确定LDH基因在不同病理类型的甲状腺癌中表达有差异。随后通过构建经多西环素（Doxycycline，DOX）控制表达的重组慢病毒载体Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb，感染甲状腺未分化癌Hth83细胞系，建立稳定的基因沉默可控的细胞系。然后对该慢病毒感染的细胞行单克隆筛选，找到LDHa、LDHb基因表达可被持续、稳定沉默的单克隆细胞系。研究shLDHa、shLDHb基因的表达，对ATC细胞系肿瘤表型的影响及其对乳酸脱氢酶活性和下游产物乳酸产生的影响；进一步我们还建立了裸鼠的甲状腺区原位移植瘤模型，观察诱导下调LDHa基因的ATC细胞系在裸鼠体内的成瘤能力；验证在裸鼠体内抑制LDHa基因对肿瘤乳酸脱氢酶蛋白的生成及酶活性的影响。本课题的研究不仅有助于阐明肿瘤代谢途径中关键酶LDH在ATC中的生物学功能和对肿瘤生长代谢的影响，还可能为ATC的治疗提供新的思路和干预靶点。　　第一章：重组慢病毒Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb在ATC细胞系Hth83中的制备及生物功能的研究　　第一部分：重组慢病毒Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb在ATC细胞系Hth83中的制备、鉴定及单克隆筛选　　方法：　　1.扩增可诱导表达基因沉默的线性化载体p Inducer-EmGFP-mirRNA。　　2.设计LDHa、LDHb基因的干扰片段，制备线性化干扰载体，经退火、连接、转化、鉴定，构建LDH基因干扰慢病毒载体Lenti-shLDHb、Lenti-shLDHa。　　3.慢病毒进行包装、纯化、浓缩，利用梯度稀释法测定病毒滴度，用感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）=10、25、50、75、100、200、500对Hth83细胞感染后，通过荧光观察测定绿色荧光细胞占细胞总数的比例。　　结果：　　1.在原有Hth83细胞系成功转染Luciferase蛋白的基础上，成功构建了慢病毒感染的LDH抑制表达可控的细胞系Hth83-shLDHa、Hth83-shLDHb，绿色荧光显示表达效率高达75%以上，可以满足后续实验要求。　　2.不同DOX浓度和时间下诱导抑制shLDHa、shLDHa基因表达后，Western-blot检测显示LDHa、LDHb蛋白表达均可得到明显的抑制。高浓度DOX诱导抑制后显微镜下观察Hth83细胞生长受抑，细胞分散，可见细胞碎片，细胞挛缩。　　第二部分：单克隆Hth83细胞系中抑制LDH表达对细胞功能、酶活性及乳酸的影响　　方法：　　1.乳酸检测试剂盒检测单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18经DOX诱导shLDHa、shLDHb基因的表达后，细胞内乳酸生成的变化。　　2.利用乳酸脱氢酶试剂盒检测单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18经DOX诱导shLDHa、shLDHb基因的表达，细胞内乳酸脱氢酶的活性。　　3.以MTT法检测单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18经DOX诱导shLDHa、shLDHb基因的表达，对细胞增殖能力的影响。　　4.平板实验法检测单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18经DOX诱导shLDHa、shLDHb基因的表达，对细胞单克隆形成能力的影响。　　5.划痕实验法检测单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31经DOX诱导shLDHa基因的表达，对细胞迁徙能力的影响。　　6.利用流式细胞仪检测单克隆细胞系细胞Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31经DOX诱导shLDHa基因的表达，检测凋亡细胞数改变。　　结果：　　1.以加入DOX后诱导shLDHa、shLDHb表达的为实验组，不加DOX的为对照组。当DOX作用Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31细胞24小时后，实验组较对照组乳酸含量下降（p＜0.05）；但作用96小时后乳酸含量实验组较对照组无明显差异；且不同浓度的DOX诱导对肿瘤乳酸的产生无明显差异（p＞0.05）。DOX作用Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18细胞24小时后，高浓度DOX诱导组乳酸的产生均出现轻度降低；但在Hth83-shLDHb-18细胞低浓度实验组乳酸含量与对照比较无明显差异（p＞0.05）。作用96小时后乳酸的产生在Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18细胞高、低浓度DOX实验组较对照组均无差异（p＞0.05）。　　2.实验组加入DOX沉默Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31细胞LDHa表达后，乳酸脱氢酶活性较对照组均明显降低（p＜0.05）。且高浓度DOX诱导组较低浓度组，乳酸脱氢酶活性降低更明显；随着作用时间延长到96小时，乳酸脱氢酶活性进一步减低（p＜0.05）。Hth83-shLDHb-18细胞DOX作用24小时后乳酸脱氢酶活性较对照组轻度降低（p＜0.05）；但Hth83-shLDHb-6实验组较对照组，乳酸脱氢酶活性无差异（p＞0.05）。96小时组Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18实验组较对照组乳酸脱氢酶活性无明显差异（p＞0.05）。　　3.Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31细胞实验组以DOX诱导24小时后，较对照组细胞活性无明显差异；DOX诱导48、72、96小时后实验组较对照组细胞活性明显降低，且随着DOX抑制浓度的增加，细胞活性明显降低（p＜0.05）。Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18细胞系DOX诱导24、48、72小时后，实验组较对照组细胞活性无明显差异；DOX诱导96小时后实验组较对照组细胞活性降低（p＜0.05）。　　第二章：抑制LDH对裸鼠移植瘤生长及代谢的研究　　方法：　　1.于裸鼠甲状腺内原位种植Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31细胞系，建立人移植瘤动物模型。　　2.注射后第5天开始，分别给予含有和不含有DOX的饮食，诱导shLDHa基因的表达，每两至三天应用影像系统动态监测肿瘤体积变化和瘤重。　　3.实验组及对照组分别给予含或不含DOX的饮食，待移植瘤模型建立稳定后，每组分别取出3只裸鼠的移植瘤组织，用蛋白印迹实验检查移植瘤组织内LDHa表达。　　4.实验组及对照组分别给予含或不含DOX的饮食，待移植瘤模型建立稳定后，每组分别取出3只裸鼠的移植瘤组织，用乳酸脱氢酶检测试剂盒检测组织内LDH的活性。　　5.监测人肿瘤移植模型裸鼠的总生存期，绘制生存曲线。　　结果：　　1.成功建立了LDHa基因表达下调的ATC原位裸鼠移植瘤模型。　　2.实验组裸鼠肿瘤生长慢于对照组，接种1周后小动物活体荧光成像系统显示实验组荧光强度显著低于对照组（P=0.003）。且实验组裸鼠剥除的瘤体体积及重量小于对照组（P=0.0031和P=0.002）。　　3.LDHa蛋白表达量在实验组肿瘤组织中的表达低于对照组（P=0.286）。　　4.乳酸脱氢酶活性在实验组肿瘤组织中的表达低于对照组（P=0.231）。　　5.实验组人肿瘤移植模型裸鼠的总生存期长于对照组裸鼠的总生存期。　　结论：　　1.oncomine数据库中提示LDHa在甲状腺未分化癌中高表达，提示LDH在甲状腺未分化癌中有良好的研究前景。　　2.抑制LDHa基因能够有效抑制Hth83细胞的增殖及肿瘤克隆的形成，但对细胞的迁徙能力及细胞周期无显著影响。　　3.LDHa或LDHb表达的抑制，均能够有效的降低Hth83细胞内乳酸脱氢酶的活性，并暂时性的降低了乳酸的浓度。　　4.慢病毒转染的方法沉默LDHa、LDHb，对Hth83细胞系乳酸脱氢酶、乳酸的产生均有抑制作用；但沉默LDHa的效果要好于沉默LDHb。　　5.裸鼠体内表达shLDHa可抑制LDHa蛋白的生成和酶的活性。　　6.裸鼠体内抑制LDHa，可显著抑制人甲状腺癌移植瘤的生长，延长了异种移植瘤裸鼠的生存期。提示LDHa有可能作为ATC患者的潜在治疗靶点。