【背景】人硫酸酯酶1（hSulf-1）基因位于8号染色体长臂8q13.3上，大小约257Kb，开放阅读框架（open reading frame，ORF）长2616bp，编码871个氨基酸残基。氨基酸序列可分为4段：信号肽（23AA），硫酸酯酶结构域（373AA），亲水结构域（346AA）和C端结构域（109AA）。hSulf-1能够特异性水解硫酸乙酰肝素（HS）链上的6-氨基葡萄糖硫酸酯键，将6-O-氨基葡萄糖从HS链上解离下来。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）能够稳定肝素结合生长因子受体类信号通路，其功能发挥有赖于完整的HS链。当hSulf-1表达时，HSPG的硫酸化状态下降，信号通路稳定性下降，能够传导至胞内的有效信号减少，从而降低细胞增殖等。因此hSulf-1被认为是细胞功能下调基因，能够影响肝素结合类生长因子及wnt信号通路等。其在多种肿瘤组织，如肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌中表达下调，但在胰腺癌中表达上调，其变化与肿瘤具有相关关系且与部分肿瘤的预后相关。hSulf-1在胆囊癌中的表达情况尚不清楚，其在胆囊中表达状态与肝素结合生长因子受体类信号通路的关系也不清楚。hSulf-1在间质（包括间质细胞和基质）中的表达也未见报道，因此其在间质中表达有无改变也不清楚。本研究采取临床手术中的胆囊癌肿瘤组织及非肿瘤组织、淋巴结组织，采用免疫组织化学的方法进行蛋白表达的原位检测，同时检测了几种常见的细胞信号通路蛋白，采用光密度软件测定蛋白表达光密度值，经过统计分析，分别观察hSulf-1在非肿瘤及肿瘤胆囊间质、上皮、淋巴结中的表达。并分析其表达对部分细胞信号通路的影响及其与部分信号通路蛋白的相互关系。通过干扰间质细胞hSulf-1表达进一步分析间质细胞hSulf-1表达改变后对肿瘤细胞趋化能力的影响。饮酒与人类生活息息相关，根据世界卫生组织报道，58%的成年人在最近的12个月内饮过酒。研究表明，乙醇与多种癌症的发生有关，但是乙醇与癌症侵袭转移的关系尚不明确：有文献认为二者不相关；也有文献认为饮用不同浓度的酒精对癌症侵袭转移的影响不同，高浓度抑制、低浓度促进、中等浓度不相关；此外也有文献认为中低浓度抑制、高浓度促进；尚有文献认为，摄入酒精的量是决定因素，重度酗酒者癌症侵袭转移加快，中等量或低等量饮酒则无明显影响。乙醇与癌症侵袭转移的相关关系有了明确的定论后，可以解决以下临床问题：1，为预防癌症的早期侵袭转移，健康成年人群是否有必要适量饮酒？2，已经明确诊断的癌症患者，本来有饮酒习惯者是否需要戒酒？本来无饮酒习惯者，是否有必要适量饮酒？在将来的实验研究中可以将低表达hsulf-1的胆囊癌细胞系进行转染使其正常表达hsulf-1，此时再检验乙醇刺激对胆囊癌细胞迁移侵袭的影响，从而可以判断hsulf-1有没有在该过程中发挥作用。第一部分hSulf-1在胆囊癌间质中表达下降【目的】检测临床手术中取得的胆囊癌患者组织标本间质组织中hSulf-1的表达，明确与非肿瘤间质组织相比，hSulf-1在胆囊癌间质中表达。【方法】取上海东方肝胆外科医院2012-2至2013-09收治的胆囊癌患者的胆囊肿瘤及其非胆囊癌组织，排除术后病理结果回报中报告为非胆囊癌者，共取得84组组织：胆囊肿瘤组织84例，胆囊非肿瘤组织84例。将组织经石蜡包埋，制作成组织芯片，每张芯片上84个组织点。采用免疫组化方法在组织芯片上检测hSulf-1及一系列相关蛋白。对结果采用IPP6.0软件进行光密度分析，对光密度值再采用SPSS20.0进行统计分析。【结果】配对t检验分析了hSulf-1在胆囊肿瘤间质组织及非肿瘤对照间质组织中的表达情况。在α=0.05水准，hSulf-1在非肿瘤胆囊间质组织及胆囊肿瘤间质组织中的光密度差异具有统计学意义。【结论】与非肿瘤胆囊间质组织比较，hSulf-1在胆囊癌间质组织中的表达下降。第二部分间质细胞hSulf-1表达改变影响其对肿瘤细胞趋化作用【目的】验证间质细胞中hsulf-1表达改变是否影响其对胆囊癌细胞的趋化作用。【方法】人胚肺成纤维细胞系MRC-5能够正常表达hsulf-1。采用shRNA-hsulf-1质粒转染MRC-5来抑制hsulf-1表达。随后将hsulf-1表达抑制的MRC-5与人胆囊癌细胞系EHGB-1进行transwell共培养。EHGB-1放在上室，MRC-5放在下室。【结果】shRNA-hsulf-1质粒转染MRC-5组，其上室细胞穿透小室的数目比阴性对照及空白对照数目多。【结论】hSulf-1在间质细胞MRC-5中表达下降后，间质细胞MRC-5对胆囊癌细胞EHGB-1的趋化能力增强。第三部分胆囊癌上皮hsulf-1表达与预后及若干相关信号分子表达【目的】检测临床手术中取得的胆囊癌患者组织标本中hSulf-1的表达及TGF-β/α-SMA、wnt/β-catenin、MAPK/ERK、PI3K/AKT、EGF/EGFR及fibronectin等信号通路中部分蛋白的表达情况，明确hSulf-1在胆囊癌中表达是上调、下调或不变，若有变化，哪些蛋白表达会随之变化。以及表达改变对预后有无影响。【方法】取上海东方肝胆外科医院2012-2至2013-09收治的胆囊癌患者的胆囊肿瘤及其非肿瘤胆囊组织，排除术后病理结果回报中报告为非胆囊癌者，共取得84组组织：胆囊肿瘤84例，胆囊非肿瘤84例。将组织经石蜡包埋，制作成组织芯片，每张芯片上84个组织点。采用免疫组化方法在组织芯片上检测hSulf-1及一系列相关蛋白。对结果采用IPP6.0软件进行光密度分析，对光密度值再采用SPSS20.0进行统计分析。按照染色强度及染色细胞数目将hsulf-1表达分成高表达组及低表达组，分析hsulf-1表达与预后的关系。【结果】配对t检验分析了hSulf-1、TGF-β、α-SMA、β-catenin、p-ERK、p-AKT、p-EGFR及fibronectin等蛋白在肿瘤组织及正常对照组织中的表达情况。在α=0.05水准，hSulf-1、TGF-β、α-SMA、β-catenin、p-ERK、p-AKT、p-EGFR、fibronectin在正常组织及肿瘤组织中的光密度差异均具有统计学意义。散点图观察在肿瘤组织中TGF-β、α-SMA、β-catenin、p-ERK、p-AKT、p-EGFR及fibronectin的表达与hSulf-1的表达是否相关。在肿瘤组织中，TGF-β、α-SMA、β-catenin、p-ERK、p-AKT、p-EGFR及fibronectin的表达水平与hSulf-1的表达水平没有明显相关关系。散点图观察在正常组织TGF-β、α-SMA、β-catenin、p-ERK、p-AKT、p-EGFR及fibronectin的表达与hSulf-1的表达是否相关。在正常组织中，TGF-β、α-SMA、β-catenin、p-ERK、p-AKT、p-EGFR及fibronectin表达水平与hSulf-1的表达水平没有明显相关关系。尚未发现hsulf-1低表达是独立的预后危险因素。【结论】与正常组织比较，hSulf-1在胆囊癌中表达下降，TGF-β、fibronectin、β-catenin、p-AKT、p-ERK、p-EGFR、α-SMA在肿瘤组织中表达上升。在肿瘤组织中及正常组织中，尚不能认为TGF-β、α-SMA、β-catenin、p-ERK、p-AKT、p-EGFR及fibronectin的表达与hSulf-1的表达相关。尚未发现hsulf-1低表达与预后相关。根据已有研究报道，癌细胞低表达hsulf-1后能够通过上调肝素结合类生长因子信号通路从而导致肿瘤更具恶性并与不良预后相关。第四部分hsulf-1在胆囊癌淋巴结中的表达【目的】检测临床手术中取得的胆囊癌患者淋巴结组织标本中hSulf-1的表达，明确在胆囊癌转移淋巴结中hSulf-1表达。【方法】取上海东方肝胆外科医院2012-2至2013-09收治的胆囊癌患者的阳性淋巴结及阴性淋巴结，排除术后病理结果回报中报告为非胆囊癌者，共取得淋巴结60例：阳性淋巴结30例，阴性淋巴结30例。将组织经石蜡包埋，制作成组织芯片，每张芯片上60个组织点。采用免疫组化方法在组织芯片上检测hSulf-1及一系列相关蛋白。对结果采用染色强度判定来界定其表达强弱。分析阳性及阴性淋巴结中hsulf-1表达的高低。【结果】阳性淋巴结与阴性淋巴结中hsulf-1表达率有差异。【结论】与阴性淋巴结相比较，hSulf-1在胆囊癌阳性淋巴结中表达率下降。第五部分乙醇对胆囊癌细胞系迁移、侵袭能力的影响【目的】观察一定浓度乙醇刺激下，肿瘤细胞在迁移、侵袭能力方面发生的变化，以期从一定程度上揭示饮酒对肿瘤患者（包括携带者）肿瘤病情发展的影响。【方法】分别以不同浓度的乙醇刺激胆囊癌细胞EHGB1、EHGB2。对乙醇刺激的EHGB1行细胞划痕实验，对乙醇刺激的EHGB1行transwell实验。用western blot检测乙醇刺激下EHGB1、EHGB2部分侵袭转移相关通路蛋白的表达。【结果】细胞划痕实验中，经乙醇刺激后的EHGB1其迁移距离与未经乙醇刺激的EHGB1相比较，迁移距离缩短；transwell实验中，乙醇刺激使EHGB1穿透小室的细胞数量减少。乙醇刺激后，在EHGB1细胞，fibronectin的表达下降；在EHGB2细胞，p-AKT表达下降、EpCAM表达上升。【结论】2.0mg/ml的乙醇能够抑制体外培养胆囊癌细胞EHGB1和EHGB2的侵袭和转移，可能与EpCAM表达上升相关。