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目的:研究ALS相关蛋白UBQLN2对线粒体质量控制的调节作用及具体机制,深入了解ALS发病的分子基础,为开发靶点药物提供理论依据。方法:(1)分子生物学实验:已获得新型的线粒体自噬荧光报告基因mt-Keima,UBQLN2、Parkin、HSP70和泛素(Ubiquitin)等的野生型和突变型表达质粒已经制备成功,所有质粒均通过测序验证,并且在带有不同标签蛋白的表达载体中都表达较好;(2)细胞生物学实验:在HEK293细胞系中利用Lipofectamine 2000脂质体转染表达相关蛋白,利用RNAiMAX进行siRNA转染实验以沉默相关蛋白;原代培养神经元中利用RNAiMAX或病毒包装的方式进行转染实验以沉默或表达相关蛋白;用免疫荧光染色的方法观测蛋白定位以及共定位情况;(3)生物化学实验:收集实验相关细胞,利用免疫印迹的方法使用常规一抗、二抗及ECL化学发光的方法检测蛋白水平、细胞内信号通路的变化;利用免疫共沉淀的方法鉴定蛋白在细胞内的结合。结果:(1)UBQLN2在Parkin的泛素化作用下可以依赖其UBA结构域被转运至受损的线粒体上,随后该线粒体会被清除;(2)我们利用线粒体自噬报告基因mt-Keima证明了 UBQLN2参与PINK1/Parkin介导的自噬过程,随后证明了这是一个以K48和K63为主的多泛素链参与的过程;(3)分子机制方面,UBQLN2可以和分子伴侣HSP70结合,形成的UBQLN2-HSP70复合体可以帮助UPS降解OMM而使IMM暴露最终使受损线粒体被清除;(4)ALS病理突变体在一定程度上破坏了其转运至受损线粒体的过程,也阻碍了受损线粒体被清除,机制方面,突变体与HSP70的结合会减弱,形成的复合体对OMM的降解也有所抑制。(5)神经元相关实验也证实了 UBQLN2对线粒体质量控制具有重要的作用。结论:UBQLN2与HSP70结合形成复合体通过PINK1/Parkin介导的线粒体质量控制通路帮助降解受损线粒体外膜蛋白,ALS突变体会阻碍这一过程使受损线粒体不能被及时清除。