一、目的和意义： 在机体的衰老过程中，微血管的一个重要功能变化是血管通透性增加，这直接涉及到内皮细胞屏障功能的改变，而后者与细胞骨架的主要组件——纤维状肌动蛋白(F-actin)的分布是密切相关的。研究提示晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)与衰老所致血管通透性增高有密切关系。本研究试图通过观察AGE对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)的增殖活力和F-actin的形态学影响，探讨AGE导致衰老相关血管并发症的病理生理学基础。同时，本研究试图建立稳定的D-半乳糖的内皮细胞衰老模型并观察衰老刺激对内皮细胞中F-actin的形态学影响，为进一步在细胞水平研究人类衰老自然过程的机理提供理论和实验依据。 二、材料与方法： 本实验分为两个部分，分别研究AGE和D—半乳糖对HUVEC的功能和形态学的影响。 第一部分实验将HUVEC分为两组，分别为正常组和AGE处理组，采用四唑盐(MTT)比色法绘制细胞活力曲线。将两组HUVEC分别接种于微孔培养皿，分别于培养时间第1～6天对两组细胞进行F-actin的荧光染色。 第二部分实验将HUVEC分为三组，分别为正常组、D-葡萄糖处理组和D-半乳糖处理组。采用台盼蓝排除法分别绘制细胞增殖曲线。在此衰老模型的基础上，将三组HUVEC分别接种于微孔培养皿培养9—12天，再进行F-actin的荧光染色。 F-actin荧光染色的方法：2％多聚甲醛20℃固定10min；0.5％TritonX-1004℃孵育30min；0.5％牛血清白蛋白于4℃孵育45min，最后用2U／ml罗丹明—鬼笔环肽于4℃孵育40min。每步处理之间均用4℃PBS缓冲液充分漂洗。最后微孔培养皿直接置于相差荧光倒置显微镜上镜检并摄片，激发荧光波长为565nm。 三、结果分析： 第一部分：AGE处理组HUVEC的活力曲线与正常组相比显著下移，对代表细胞活力的OD值进行两样本均数的t检验，P值均小于0刀1，说明AGE对内皮细胞的增殖活力具有明显的抑制作用。 荧光染色发现：正常组HUVEC的F－actin纤维主要富积于毗邻细胞膜的周边，形成典型的鹅卵石样形态，胞质中未见密集的F－actin纤维。AGE处理组细胞内的F－actin纤维形态和分介发生明显的改变，出现应力纤维、丝状伪足和板状伪足三种异常形态；至刺激后期，大部分细胞周边的F－actin纤维消失，胞质中出现密集的应力纤维，细胞间缝隙形成和扩大。这种现象说明内皮细胞致密外周带Menseperipheralband，DPB）内的F．actin在AGE的刺激下重新分布，扩散进人胞质，形成应力纤维，有利于细胞收缩和变形，最终导致内皮屏障受损，血管通透性增高。 第二部分实验有类似的结果：D－半乳糖处理组HUVEC的增殖曲线与正常组和D－葡萄糖处理组比均显著f移，统计学检验提示这种差异有显著性，说明D－半乳糖明显抑制内皮细胞的生长和增殖。 荧光染色发现：连续培养9天后，正常组细胞的F－actin形态保持不变；而D－半乳糖处理组细胞DBP中的F－actin夫去清晰锐利的轮廓，从富积于细胞膜周边向扩散于细胞质的状态转变，至后期细胞质内出现典型的应力纤维。上述现象提示D一半乳糖刺激促使Factin发生了重新分布，并且与AGE刺激下F《ctin的变化趋势一致，因而从另外一个角度证明了D一半乳糖衰老模型的机理。 四、结论： 1．AGE对内皮细胞的增殖活力有明显的抑制作用。同时，AGE促使内皮细胞肌动蛋白发生重组，即F－actin从位于细胞膜周边的状态转为弥散于整个细胞质的状态，内皮细胞收缩，胞间裂隙形成，进而血管通透性增高。这种形态学变化反映了内皮细胞的结构和功能的改变。 2、本研究在国内首次建立起内皮细胞的D－半乳糖衰老模型。同时发现D．半乳糖对内皮细胞的增殖和细胞内F－actin的形态和分布具有类似于AGE的影响，D－半乳糖可能是通过增加 AGE的含量和促进氧自山 一6 一基作用等方式产生上述作用的。 3、本研究验证了 AGE和 D－半乳糖对人脐静脉内皮细胞部分功能和结构的影响，探讨上述两种因素在衰老所致的微血管并发症中所起的作用，为揭示人类衰老的病理生理学机制提供了一定的理论和实验依据。