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背景与目的:
非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌常见的类型，预后较差，治疗易耐药。免疫治疗是近年来科学工作者广泛认同的较为理想的肿瘤治疗方法，但免疫治疗对NSCLC的疗效甚微，其疗效的提高有赖于对肿瘤局部免疫微环境的深入了解。B7-H4是共刺激分子，参与T淋巴细胞介导免疫应答的负性调控。大部分的人类肿瘤细胞表面表达B7-H4。B7-H4与NSCLC的相关性研究，目前国内外研究主要集中在B7-H4表达与NSCLC的临床病理及预后的相关性，而B7-H4表达对NSCLC的生物学行为和免疫反应有何影响尚未见报道，其在细胞内相关信号通路及调控机理尚待深入研究。我们的研究首先探讨B7-H4在NSCLC组织中的表达及其与临床病理及预后的关系，进一步检测人NSCLC细胞系中B7-H4基因mRNA的表达状况及构建B7-H4特异的RNA干扰(RNAi)质粒载体，研究NSCLC B7-H4基因表达沉默对细胞增殖、侵袭、黏附和细胞周期的影响，并与Jurkat细胞共培养，探讨B7-H4分子对免疫反应中T淋巴细胞功能的影响。最后探讨IFN-α和IFN-γ对A549细胞B7-H4mRNA和蛋白表达的影响。为今后进一步研究B7-H4表达调控机理，进而研究B7-H4在细胞内相关信号通路，为肿瘤免疫干预提供新的思路。
方法:
1、收集102例NSCLC患者的癌组织标本及临床病例资料，免疫组织化学法检测NSCLC组织中B7-H4蛋白的表达以及T淋巴细胞亚群的浸润，分析B7-H4的表达与NSCLC患者临床病理特征及T淋巴细胞浸润的相关性。
2、RT-PCR法检测人NSCLC细胞株SPCA-1、GLC-82、A549中B7-H4基因mRNA的表达。
3、将B7-H4短发夹状RNA(short hairpin RNA，shRNA)序列克隆到质粒pGCsi-U6/Neo载体，采用脂质体介导的转染方法将构建的B7-H4 shRNA表达质粒转入A549细胞，建立稳定转染细胞株。RT-PCR、Western Blot检测B7-H4基因表达沉默前后细胞的B7-H4表达变化，MTT实验以及平板克隆形成实验观察B7-H4基因表达沉默对A549细胞增殖能力影响，Transwell小室实验检测B7-H4基因表达沉默对A549细胞的迁移能力影响，流式细胞仪检测B7-H4基因表达沉默对A549细胞的细胞周期影响。
4、将Jurkat细胞与B7-H4基因表达沉默的A549细胞共培养，MTT法检测B7-H4基因表达沉默对共培养的Jurkat细胞抑制的影响，流式细胞术检测B7-H4基因表达沉默对Jurkat细胞的细胞周期影响，RT-PCR、Western Blot检测B7-H4基因表达沉默对Jurkat细胞的细胞因子IL-2及IL-10影响。
5、用不同浓度(100、500、1000、2000U·ml-1)的IFN-α和IFN-γ分别处理A549细胞，RT-PCR、Western Blot检测IFN-α和IFN-γ对A549细胞的B7-H4表达的影响。
结果:
1、102例NSCLC组织中，B7-H4表达的阳性率为56.9％，B7-H4可表达于肺癌细胞的胞膜、胞浆内或二者均有表达，阳性者表达强度大部分在(++)以上。不同年龄、性别、吸烟史或分化程度患者B7-H4阳性表达率间均无显著性差异（P＞0.05）;发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移患者B7-H4的阳性表达率间有显著性差异（P＜0.05），B7-H4阳性TILs的数量低于B7-H4阴性TILs的数量(P＜0.05）。
2、B7-H4基因在人NSCLC细胞株SPCA-1、GLC-82、A549中呈阳性表达。
3、成功构建质粒表达载体能有效地干扰A549细胞B7-H4mRNA和蛋白质表达水平。RT-PCR和Western Blot检测显示阳性转染组B7-H4表达较空白对照组、空载质粒组降低。MTT结果表明随着细胞培养时间的逐渐延长，阳性转染组细胞的细胞增殖抑制率递增，较空白对照组及空载质粒组细胞存在显著差异(P＜0.05)，而空白对照组和空载质粒组间无显著差异（P＞0.05）。平板克隆形成实验结果显示阳性转染组的克隆形成数为158.3±9.452，明显低于空白对照组（克隆形成率为243.3±12.34）(P＜0.05)。Transwell小室实验结果显示与空白对照组（迁移细胞数为128.32±10.50）以及空载质粒组(迁移细胞数为119.35±4.73)相比，阳性转染组的迁移细胞数（87.67±9.07）明显减少(P＜0.05)。与空白对照组（穿过基底膜细胞数为39.72±3.50）以及空载质粒组(穿过基底膜细胞数为37.01±1.74)相比，阳性转染组的穿过基底膜细胞数（23.14±2.08）减少（P＜0.05）。空白对照组、空载质粒组和阳性转染组三组A549细胞株经流式细胞仪检测细胞周期，阳性转染组G0/G1期和G2/M期细胞数量分别为35.51±4.11％和35.37±1.87％，空白对照组（G0/G1期和G2/M期细胞数量分别为31.22±3.34％和44.72±2.41％）及空载质粒组（G0/G1期和G2/M期细胞数量分别为30.42±2.45％和45.04±2.69％），提示阳性转染组A549细胞呈G0/G1期阻滞，而G2/M期细胞数量分布减少，细胞增殖受抑。
4、MTT实验结果显示随着时间的延长，与阳性转染组共培养的Jurkat细胞的细胞增殖能力明显较与空白对照组及空载质粒组共培养的Jurkat细胞增高(P＜0.05)。细胞生长至48h，与阳性转染组共培养的Jurkat细胞细胞增殖抑制率明显超过与空载质粒组和空白对照组共培养的Jurkat细胞(P＜0.05)。而空白对照组和空载质粒组间比较无显著差异(P＞0.05)。流式细胞仪结果显示与阳性转染组共培养的Jurkat细胞的G0/G1期细胞为37.28±3.35％，明显低于空白对照组（63.36±5.45％）以及空载质粒组(66.05±6.02％)(P＜0.05);与阳性转染组共培养的Jurkat细胞的S+G2/M期细胞为62.76±5.56％，明显高于空白对照组（36.65±3.28％）以及空载质粒组(33.92±3.64％)(P＜0.05)。与阳性转染组共培养的Jurkat细胞的细胞凋亡水平为0.27±0.07％，明显低于空白对照组（5.36±0.45％）以及空载质粒组（6.14±0.36％）（P＜0.05），空白对照组和空载质粒组细胞凋亡水平无显著差异（P＞0.05）。RT-PCR结果显示与阳性转染组共培养的Jurkat细胞的IL-10和IL-2mRNA表达量分别为1.12±0.12和1.21±0.02，均明显高于空白对照组（0.89±0.09和0.89±0.09）以及空载质粒组(0.91±0.08和0.87±0.08)(P＜0.05);同时，Western Blot结果显示阳性转染组组的IL-10和IL-2蛋白表达分别为1.98±0.02和1.46±0.02均明显高于空白对照组(0.89±0.09和0.92±0.09)以及空载质粒组(0.87±0.08和0.93±0.09)(P＜0.05)。
5、随着IFN-α浓度的增加，A549细胞B7-H4mRNA表达增强，组间相比差异具有显著差异(F=13.30，P＜0.05)。而随着IFN-γ浓度的增加，A549细胞B7-H4mRNA表达变化组间相比差异无显著性(F=16.54，P＞0.05)。随着IFN-α浓度的增加，B7-H4蛋白表达增强，组间相比差异具有显著性(F=18.69，P＜0.05)，而随着IFN-γ浓度的增加，A549细胞B7-H4蛋白表达变化不明显，组间相比无明显差异(F=17.46，P＞0.05)。
结论:
1、B7-H4在NSCLC组织中高表达，且B7-H4表达水平与NSCLC淋巴结转移呈正相关，与肺癌组织CD3+T淋巴细胞浸润程度呈负相关，B7-H4可能在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。
2、SPCA-1、GLC-82、A549细胞表达B7-H4基因。
3、成功构建靶向B7-H4基因的shRNA表达载体，转染A549细胞，能有效抑制细胞的B7-H4mRNA和蛋白表达。抑制B7-H4基因可抑制A549细胞的增殖，抑制A549细胞的迁移能力，降低A549细胞的侵袭能力，经流式细胞仪检测细胞周期，抑制B7-H4基因可使A549细胞G0/G1期阻滞，而G2/M期细胞数量分布减少，细胞增殖受抑制。
4、B7-H4基因表达沉默能够有效增加T淋巴细胞的增殖能力。B7-H4基因表达沉默可以减少T淋巴细胞细胞凋亡，有效上调T淋巴细胞的IL-10和IL-2表达。
5、IFN-α可增强B7-H4mRNA和蛋白水平的表达，而IFN-γ对B7-H4分子mRNA和蛋白表达影响不明显。