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高盐严重影响植物的生长发育,导致农作物减产。加强植物耐盐机制的研究对提高植物的耐盐性以及农作物的产量具有重要意义。U-box型E3泛素连接酶是泛素系统的关键酶,参与调控许多生物学过程。已有研究发现多种U-box蛋白在植物的非生物胁迫过程中起着重要作用。我们从小麦中克隆到了一个编码U-box蛋白的基因TaPUB26。接着对该基因进行序列比对及进化分析,并检测了该基因的表达模式。为了研究该基因在植物耐盐性中的功能,将该基因异源转化单子叶模式植物二穗短柄草并获得了过表达TaPUB26的转基因植株。利用转基因二穗短柄草研究了TaPUB26在植物耐盐性中的功能机制。主要结果如下:(1)通过对转录组数据分析,发现了一个盐胁迫下高度上调的U-box基因TaPUB26(AK334574.1)。该基因cDNA全长1703bp,开放阅读框1341bp,编码446个氨基酸。其编码的蛋白质N端含有一个U-box结构域,C端含有ARM重复序列。研究发现,TaPUB26蛋白定位于细胞核中。通过体外泛素化实验验证发现TaPUB26具有E3泛素连接酶活性,但是这种活性依赖于E1和E2。(2)检测了TaPUB26在小麦不同组织部位以及不同逆境胁迫处理下的表达模式。结果表明,TaPUB26在小麦的根、茎和叶中均有表达,其中叶中表达量最高。NaCl、PEG、高温和多种植物激素都可不同程度地影响该基因的表达。(3)我们获得了TaPUB26转基因二穗短柄草并选取了OE2、OE5和OE8 3个过表达株系用于后续研究。检测了各转基因株系幼苗以及成苗的耐盐性,结果表明,与野生型二穗短柄草植株(WT)相比,转基因株系在盐胁迫下生长发育受到严重抑制,幼根和幼叶生长缓慢。此外,盐胁迫下转基因植株体内叶绿素含量低于WT,光合能力也相对较弱。以上结果表明过表达TaPUB26基因降低了转基因二穗短柄草的耐盐性。(4)检测了各株系根和叶细胞内Na~+、K~+积累以及离子流动。结果表明,盐处理下,转基因株系根和叶中Na~+含量都高于WT植株,而K~+含量低于WT,进而导致转基因株系中Na~+/K~+高于WT。随后检测了根表皮细胞膜内外Na~+、K~+和H~+的动态流动。结合离子积累量和Na~+、K~+和H~+的流动结果推测,盐胁迫下TaPUB26可能是通过抑制细胞内Na~+外流和促进K~+外流,破坏了细胞内的离子平衡稳态,导致转基因植株的离子胁迫耐性降低。(5)分析了TaPUB26转基因株系的ROS积累和抗氧化能力。结果表明,盐胁迫下,转基因植株中ROS含量高于WT。而且,盐胁迫后转基因株系中的MDA含量以及电解质外渗率也高于WT。盐胁迫下转基因株系的多种抗氧化酶活性却低于WT。这些结果表明,TaPUB26降低了转基因植株的耐盐性,可能是由于植株细胞内抗氧化酶活性的降低和ROS积累的增加加剧了转基因植株的氧化胁迫。(6)分析了TaPUB26转基因植株中抗氧化相关、离子转运相关等和盐胁迫耐性相关基因的表达水平,结果发现大部分被检测基因的表达量在转基因株系中的表达水平都低于WT,说明TaPUB26编码的E3泛素连接酶可能通过某些途径对胁迫相关基因的表达进行调控。(7)通过酵母双杂和双分子荧光互补实验验证,获得了一个与TaPUB26互作的蛋白TaRPT2a。分析发现该蛋白可能是26S蛋白酶体复合物中的一个ATP酶亚基。并且过表达TaRPT2a提高了转基因拟南芥的耐盐性。以上结果表明,TaPUB26负调节转基因二穗短柄草的耐盐性。在生理水平上,TaPUB26通过调节Na~+、K~+和H~+在细胞内外的流动,破坏了细胞内离子平衡。同时,TaPUB26通过降低抗氧化酶的活性,增加ROS的积累,增加了氧化胁迫,从而降低了转基因二穗短柄草的耐盐性。在分子机制方面,TaPUB26可能通过与其他蛋白(如TaRPT2a)互作,调控盐胁迫相关基因的表达,影响植物的盐胁迫耐性。