【摘 要】
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天然存在于多种植物中的咖啡酸具有广泛的药用潜力,近年来,生物合成咖啡酸得到了越来越多的关注。由于酿酒酵母是目前公认的高安全性和强生产力的工程化宿主,因此本研究将利
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天然存在于多种植物中的咖啡酸具有广泛的药用潜力,近年来,生物合成咖啡酸得到了越来越多的关注。由于酿酒酵母是目前公认的高安全性和强生产力的工程化宿主,因此本研究将利用酿酒酵母作为底盘细胞,对咖啡酸异源合成路径进行系统化理性设计和优化,以期得到高产咖啡酸酿酒酵母菌株。由于关键的细胞色素P450酶通常不能很好地在酿酒酵母细胞中发挥作用,在遗传修饰的微生物中植物衍生的天然产物的工程生物合成面临挑战。本研究利用实验室已有的酿酒酵母菌株BY4741作为底盘细胞,从几种微生物资源中募集了两种酶HpaB和HpaC,在酿酒酵母中构建功能性4-羟基苯乙酸3-羟化酶,以发挥植物来源的细胞色素P450酶对香豆酸-3-羟化酶的同工酶作用。结合酪氨酸解氨酶,来自不同资源的两种酶呈现出从底物L-酪氨酸产生咖啡酸的显著能力。我们得到了铜绿假单胞菌的HpaB(PahpaB)和沙门氏肠杆菌的HpaC(SehpaC)最相容的酶组合,经此途径咖啡酸产量比来自大肠杆菌的HpaB和HpaC组合增加高达40倍,在摇瓶培养中实现真核细胞酵母合成咖啡酸最高产量为289.4 mg/L±4.6 mg/L。这意味着我们已经有效地提高了异源酶与酵母底物的相容性。我们发现HpaB中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域周围的六个关键氨基酸残基,并认为它们对酶活性和整个途径具有关键影响。我们建立了一个有效的方法来构建一个兼容的合成生物学系统来合成非天然羟基苯丙素。
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