第一部分大鼠股薄肌皮瓣模型的建立【目的】构建大鼠股薄肌瓣模型,对股血管为蒂的股薄肌瓣血管进行详细的解剖学观察,并总结手术切取技巧,为显微外科、缺血再灌注和再生医学构建实验模型提供依据。【方法】6只SD大鼠(280-300g)用Microfil染料血管灌注,并解剖观察股薄肌瓣血管和Micro CT扫描。6只Lewis大鼠(250-280g)手术观察股薄肌瓣血管。9只Nude大鼠(150-300g)手术观察股薄肌瓣血管,其中6个新鲜冰冻股薄肌瓣,分为3组,以0.2ml/min、0.5ml/min和1.0ml/min印度墨汁灌注血管,观察肌肉外观情况。12个新鲜股薄肌皮瓣,以0.5ml/min印度墨汁灌注血管,大体观和组织学观察毛细血管灌注情况。【结果】不同种属、不同体重大鼠,股薄肌瓣血管解剖相似。大鼠下肢位于外展位时,容易分辨股薄肌和半腱肌间隙。股动脉和股静脉伴行股神经,其外侧有3个主要分支,内侧有恒定2支分别供应股薄肌浅层和深层。股薄肌内侧起源骶骨,止于股骨的内侧面。闭孔神经分为浅支和深支,有伴行血管,分别供应股薄肌浅层和深层。在显微镜下观察新鲜大鼠的股薄肌瓣,用直径0.75mm导管插入股动脉后,肝素钠盐水灌注股薄肌瓣的股动脉,股静脉回流通畅,肌肉无肿胀,无血管侧漏。在显微镜下观察新鲜冰冻大鼠股薄肌瓣,用肝素钠盐水灌注股薄肌瓣的股动脉,肌肉明显肿胀,未见股静脉回流。墨汁以不同流速灌注新鲜冰冻大鼠股薄肌瓣的股动脉,可观察肌瓣有墨汁漏出。印度墨汁以0.5ml/min流速灌注新鲜冰冻大鼠股薄肌瓣,肌瓣稍肿胀,毛细血管隐约可见且分布均匀。印度墨汁以0.5ml/min流速灌注新鲜大鼠股薄肌瓣,大体观肌肉血管网被墨汁均匀染色。组织学HE染色提示肌肉毛细血管网有墨汁存在。【结论】150-300g的SD、Lewis和Nude大鼠,按本研究手术方法,较容易切取以股动脉为血管蒂的股薄肌瓣。该肌瓣能获取较长的血管蒂,切取形式具有多样性,股动脉口径均能被直径0.75mm导管插入。首次解剖学发现大鼠股薄肌营养血管完整性。除了来自股动脉肌支血管以外,还有来自内收肌肌支神经的伴行血管。墨汁以0.5 ml/min灌注大鼠股薄肌瓣,肌肉毛细血管可见墨汁存在。为灌注法制备去细胞股薄肌生物支架设定合适流速提供依据。第二部分灌注法制备大鼠去细胞股薄肌生物支架【目的】探讨动脉灌注法制备大鼠去细胞股薄肌瓣生物支架的效果。【方法】在显微镜下切取20个Lewis大鼠股薄肌瓣,用直径0.75mm导管插入股动脉后,以0.5ml/min流速灌注去污剂(1%SDS+1%Triton),制备去细胞股薄肌生物支架,行大体观、肌肉支架血管灌注观察、组织学、激光共聚焦显微镜、透视电镜观察和DNA定量检测方法,评价去细胞股薄肌瓣生物支架的效果。【结果】在显微镜下成功切取股薄肌瓣20个。股薄肌瓣大小约2.5cm X 2.0 cm,重268±42mg。用灌注法制备14个大鼠去细胞股薄肌瓣,去细胞股薄肌皮瓣大小约2.2 cm X 1.8 cm,重160±30mg。外观呈半透明样改变,与制备前的肌瓣比较体积缩小,重量减轻。有1个股薄肌去细胞效果不满意。去细胞肌肉支架血管观察和血管灌注显示动脉和静脉网络完整,但动脉灌注液体不能从静脉回流。光学倒置相差显微镜观察到去细胞肌肉支架呈半透明,以及肌肉支架内不同口径的血管网。去细胞肌肉支架交替灌注PBS和DMEM后,灌注液可均匀充盈去细胞肌肉支架。正常肌肉HE染色结果显示具有肌纤维和和多核现象。去细胞肌肉支架HE染色为细胞外支架结构,纤维排列整齐,孔隙大小均匀,未见残留肌细胞。正常对照组神经束膜内见蓝染的细胞核、束膜间质和束膜内结构致密;去细胞股神经和内收肌肌支神经支架内,无蓝染的细胞核,束膜间质和束膜内结构与正常对照组相比稍疏松。正常股动脉和股静脉HE染色显示血管内大量细胞残留,去细胞股动脉和股静脉支架管腔内未见细胞核残留,其细胞外基质保留完好。共聚焦显微镜观察正常肌肉横切面,Dapi染色的正常肌肉横切面可见肌细胞多核现象,细胞核在荧光下观察成椭圆形淡蓝色。透射电镜下观察正常肌肉肌膜、线粒体和肌浆完整,肌原纤维排列整齐。去细胞肌肉支架保留了超微结构,如胶原和弹性纤维。对比正常肌肉组织结构,所有的去细胞支架肌原纤维消失,未见细胞核。透射电镜下观察新鲜神经的髓鞘、神经轴突结构完整,而去细胞神经的髓鞘和轴突均消失,可见胶原、弹性纤维和完整的基底膜。正常肌肉冻干后测量DNA为4896±1303ng/mg,去细胞支架冻干后DNA为214±37ng/mg(P=0.0001),跟正常肌肉组相比,去除95.7%DNA含量。【结论】动脉灌注法(0.5 ml/min)制备大鼠去细胞股薄肌生物支架效果好。带血管蒂肌瓣生物支架保留完整动脉和血管网。