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抗菌蛋白是一类由动物、植物等为保护其自身抵抗病原菌侵染而产生的具有不同结构的蛋白质。目前人们对抗菌蛋白的研究越来越深入,已从不同的生物体内分离得到了上百种抗菌蛋白或多肽,并对某些抗菌蛋白的结构、作用机理等研究的比较清楚。
本研究以苦瓜叶片为材料,用真空抽提法提取苦瓜叶片胞间液,将该提取液进行硫酸铵沉淀处理后得到的蛋白粗提液进行一系列的色谱分离过程,最后纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE,结果显示该蛋白已达到电泳纯,将其定名为Chit-Pr。进一步将该蛋白电转移到PVDF膜,用Edman降解法测定其N-端氨基酸序列,并进行序列比对;同时研究了Chit-Pr对植物病原真菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用。在分离纯化苦瓜叶片胞间抗菌蛋白的过程中,我们还从分离自烟草茎上的芽孢杆菌中纯化得到了一个新的抗菌蛋白 BTL,并对该蛋白进行了抗菌活性测定。上述研究的主要结果如下:
1.通过对苦瓜叶片胞间提取液进行硫酸铵沉淀、Bio-Gel P-6柱(1.6×30 cm)脱盐、HiPrepTM16/10 CM FF阳离子交换层析、HiLoadTM16/60 Superdex30凝胶过滤和SOURCE5RPC反相HPLC纯化,最终获得一个电泳纯的抗真菌蛋白,定名为Chit-Pr。
2.纯化的苦瓜叶片胞间抗菌蛋白Chit-Pr通过SDS-PAGE测得其分子量约为25000 Da;进一步将该蛋白电转移到PVDF膜后,用Edman降解法测得其N-端氨基酸序列为:NH2-VEYTITGNAGNTPGG。序列分析结果显示:该抗菌蛋白与来自颠茄中的病程相关蛋白具有较高的同源性,推测该抗菌蛋白为病程相关蛋白。
3.苦瓜叶片胞间抗菌蛋白Chit-Pr对植物病原真菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用结果显示:Chit-Pr蛋白对黑曲霉(Aspergillus niger)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum)、花生黑斑病菌(Cercospora personata)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、白菜黑斑病菌(Altenaria brassicae)、镰刀菌(Fusarium spp.)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、毛霉(Mucor sp.)的菌丝生长具有抑制作用;对花生黑斑病菌(Cercospora personata)、白菜黑斑病菌(Altenaria brassicae)的孢子萌发有较明显的抑制作用。
4.芽孢杆菌抗菌蛋白BTL的分离纯化与抗菌活性检测。通过离子交换和 SOURCE5RPC反相HPLC色谱,从芽孢杆菌中分离纯化得到一抗菌肽 BTL,TOF-MS测得其分子量为2237.690 Da,Edman降解法测得其N-端氨基酸序列为:NH2-KQQLATEAESAGPIL。该抗菌肽的平板抑菌结果显示 BTL对玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、花生黑斑病菌(Cercospora personata)、白菜黑斑病菌(Altenaria brassicae)等植物病原真菌的菌丝生长具有明显的抑制作用,并且具有热稳定性。综上所述,我们首次从苦瓜叶片胞间分离得到一个新的病程相关蛋白Chit-Pr,同时,从一株分离自烟草的芽孢杆菌培养液中分离到一个新的抗真菌肽BTL。