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核转录因子kappa B (nuclear factor kappa B, NF-κB)普遍存在于细胞胞浆中,参与多种生理、病理过程。研究表明NF-κB信号通路通过自身或与其他信号通路共同作用,在牙齿的形成和萌出过程中发挥重要功能,该信号通路的阻断可引起牙发育障碍。目前,NF-κB信号通路对人根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla, hSCAPs)的增殖及牙/骨向分化能力的影响鲜有文献报道。第一部分hSCAPs的分离培养及鉴定研究目的：获得纯化的人牙乳头干细胞。研究方法：收集根尖未发育完成的健康第三磨牙,剥离根尖牙乳头组织,酶消化法分离培养根尖牙乳头干细胞,免疫磁珠法分选纯化所培养细胞。免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测细胞表面标记物表达,验证其间充质干细胞特性。实验结果：纯化后的人根尖牙乳头细胞呈纺锤形或成纤维细胞样,贴壁生长；STRO-1阳性表达,角蛋白(CK)阴性表达,流式细胞仪结果显示其间充质干细胞表面标记(CD29、CD73、CD90、CD105和CD146)呈阳性表达,造血干细胞表面标记物(CD34和CD45)呈阴性表达。结论：通过酶消化法和免疫磁珠分选可纯化人牙乳头干细胞,体外培养时该细胞增殖活性较强,经细胞表面标记检测证实该细胞为间充质来源。第二部分hSCAPs中NF-κB信号通路的激活和抑制试验研究目的：检测NF-κB信号通路激活剂和抑制剂作用于人根尖牙乳头干细胞后,通路相关蛋白的表达。研究方法：取生长状态良好的第3代人牙乳头干细胞无血清培养24h后,分别用NF-κB信号通路经典激活剂TNF-α(10ng/mL)或特异性抑制剂BMS-345541(1μmol/L)刺激细胞,提取胞浆蛋白,western blot法检测NF-κB信号通路相关蛋白IκBα、P-IκBα、P65、P-P65的表达情况实验结果：Western blot结果显示,经TNF-a作用后,hSCAPs胞浆中P-IκBα、P-P65表达水平随时间延长而升高；BMS-345541刺激组中细胞胞浆内NF-KB信号通路蛋白磷酸化水平逐渐降低。蛋白定量分析显示在15min、30min和60min时TNF-α组P-IκBα与IκBα P-P65与P65之间比值较0min高,而BMS-345541刺激组中P-IκBα与IκBα、P-P65与P65之间比值明显低于0min,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：10ng/mL TNF-α和1μmol/L BMS-345541可有效激活和抑制NF-κB信号通路。第三部分NF-κB信号通路对hSCAPs增殖与分化能力的影响研究目的：探讨NF-κB信号通路激活或抑制状态下,对人牙乳头干细胞增殖及分化能力的影响。研究方法：分别用NF-κB信号通路激活剂和抑制剂作用于hSCAPs, MTT和流式细胞术(FCM)检测NF-κB信号通路激活或抑制后细胞增殖能力的改变,细胞划痕实验用于检测细胞迁移能力；ALP试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色与CPC溶解钙结节实验用来检测钙盐沉积情况,提取细胞总RNA和总蛋白,实时定量逆转录聚合酶链式反应实验(real-time RT-PCR)检测牙向／骨向分化相关基因(ALP、OCN、BSP、OSX、RUNX2、DSPP、OPN和DMP-1)的表达情况,蛋白免疫印迹实验(western blot)检测牙向/骨向分化相关蛋白(OCN、 BSP、OSX、RUNX2、DSP、OPN和DMP-1)的表达情况。研究结果：当NF-κB信号通路被激活后,hSCAPs增殖活性提高,通路激活组hSCAPs增殖指数明显高于对照组,体外矿化实验结果表明NF-κB通路激活组hSCAPs的ALP活性增高,形成的钙结节大而密,CPC结果显示结节中钙离子浓度升高,牙骨向分化相关基因及蛋白表达量上调,差异有统计学差异(P<0.05)。阻断NF-KB信号通路后,hSCAPs的细胞增殖指数下降,细胞开始迁移的时间延迟,距离缩短,与对照组相比NF-κB抑制组hSCAPs的ALP活性、成牙/成骨向分化相关(ALP、OCN/OCN、BSP/BS、OSX/OSX、RUNX2/RUNX2、 DSPP/DSP、OPM/和DMP-1/DMP-1)基因及蛋白的表达均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：NF-κB信号通路在hSCAPs的增殖和分化过程中发挥重要作用。