论文部分内容阅读
背景瘢痕疙瘩是一种病理性瘢痕,生物学上表现为细胞外基质过度堆积,成纤维细胞增殖活跃。其发病机制未完全明确,目前缺乏有效的诊断、治疗和复发监测手段[1,21。瘢痕疙瘩具有一定的家族聚集性和遗传性,针对瘢痕疙瘩家系的研究表明其患病常为多发,不同家系临床表现不尽相同,推测家族聚集性瘢痕疙瘩和散发性瘢痕疙瘩可能有不同的蛋白表达谱及表达特征。瘢痕疙瘩与增生性瘢痕相比,具有长期持续生长、超过原始损伤范围、反复发作、不易自行消退、肿瘤异质性及侵袭性的特点。但目前两者的鉴别诊断一般还是依靠临床表现,对于一些不典型的瘢痕疙瘩或增生明显,持续时间较长的增生性瘢痕,鉴别有一定的困难。由于临床诊断也将直接影响后续治疗计划,故找出较为科学有效的鉴别方法有着重要的意义。蛋白质是遗传物质发挥功能的直接载体,在疾病发生发展、机体反应和转归预后的各个进程中都发挥着重要的作用。目前针对瘢痕疙瘩蛋白表达的研究并不完善,探索其特异性标志物及蛋白相互作用关系对疾病诊断、鉴别、复发监测都有着重要的意义。目的获得瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、正常皮肤大体组织及血清中的蛋白质表达谱及各组标本之间的差异蛋白,分析其分子功能、参与的生物过程及蛋白相互作用关系,拟找到特异性蛋白标志物,为瘢痕疙瘩发生、发展机制提供理论和方法学依据,并能应用于瘢痕疙瘩的诊断、与其他疾病,如处于增生期的增生性瘢痕等的鉴别,瘢痕体质术前筛查,治疗预后评估及复发检测等方面。方法本课题研究以聚集性瘢痕疙瘩(familial keloid,FK)、散发性瘢痕疙瘩(sporadic keloid,SK)、增生性瘢痕(hypertrophy scar,HS)、正常皮肤(normalskin,NS)4组样本大体组织和血清为研究对象,应用同位素标记相对和绝对定量(isobarictags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术配合串联质谱分析,对其蛋白质表达量进行分析和比较,获得4组样本组织与血清中的蛋白表达情况,及各组之间的差异蛋白种类。对组间差异蛋白进行生物信息学分析,主要包括以下几方面:基因本体论(gene ontology,GO)分析、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics,KEGG)数据库通路分析、差异蛋白GO及KEGG Pathway富集分析、蛋白相邻类的聚簇分析(ClusterofOrthologousGroupsofproteins,COG)、聚类分析、蛋白质相互作用分析等方法。针对大体组织标本蛋白质组学筛选结果,挑选8个蛋白质,使用蛋白质印迹(Western blot,WB)和免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)进行技术验证,观察其表达与iTRAQ检测结果是否一致。将大体组织和血清蛋白组学筛选结果进行对比分析,找出5在两种样本中同时存在,且表达变化较大的蛋白,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)进行验证。拟找到特异性蛋白标志物,用于病理性瘢痕的诊断和鉴别。结果1、大体组织标本蛋白质鉴定及分析验证结果四组大体标本共鉴定到蛋白质2450种,筛选出p<0.05同时变化倍数在1.2倍(上下调)以上的差异蛋白,情况如下:与NS相比,FK特异性表达上调的蛋白共250种,下调281种;SK中特异性表达上调的蛋白共281种,下调232种;HS中特异性表达上调的蛋白共199种,下调233种。与SK相比,FK特异性表达上调的蛋白共64种,下调164种;HS中特异性表达上调的蛋白共79种,下调169种。与HS相比,FK特异性表达上调的蛋白共124种,下调115种。对鉴定到的蛋白质分别进行GO、KEGG注释及富集分析、聚类分析,并采用Western blot和免疫组织化学法验证了几种变化较明显的蛋白的表达,验证了 iTRAQ技术的可靠性。2、血清标本蛋白质鉴定及分析验证结果血清标本鉴定到蛋白质总数860个,筛选出p<0.05同时变化倍数在1.2倍(上下调)以上的差异蛋白,情况如下:与NS相比,FK特异性表达上调蛋白13种,下调22种;SK中特异性表达上调蛋白28种,下调25种;HS中特异性表达上调蛋白8种,下调14种。与SK相比,FK特异性表达上调蛋白16种,下调27种;与HS相比,FK特异性表达上调蛋白17种,下调蛋白5种;SK特异性表达上调蛋白24种,下调11种。对差异蛋白进行生物信息学分析,并与组织块差异蛋白对比,找出变化一致的蛋白,在NCBI网站上获取这些蛋白的基本信息,根据功能和细胞定位进行初步总结分类。通过已有知识、数据库注释和文献资料,选择5种蛋白作为候选血清学蛋白标志物进行ELISA验证。结果显示,Fibronection在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕患者血清中的表达显著高于正常对照组。结论本课题通过采用iTRAQ技术进行瘢痕疙瘩、增生性瘢痕与正常皮肤组织及血清标本的检测,获得了4组标本的蛋白质表达谱,明确了各组之间的差异蛋白质表达情况,分析了蛋白种类功能、所在通路及相互作用情况,为找到特异性蛋白标志物,揭示瘢痕疙瘩发病机制,及临床诊断、治疗、复发检测提供了坚实的基础。