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中枢呼吸化学感受器反射通过动态调节呼吸运动和排出CO2维持脑和外周组织的酸碱平衡,因此是一种维持机体稳态的重要反射。中枢呼吸化学感受器实际上是一个相互连接、相互作用的神经环路,包括几个特定脑干核团的神经元,例如斜方体后核(retrotrapezoid nucleus,RTN)和孤束核(nucleus tractus solitaries,NTS)等,能感受脑组织细胞外液的PCO2或局部H+浓度变化而激活。中枢呼吸化学感受器,最少需要满足以下几个特征:(1)对生理范围内CO2/H+的变化具有内在敏感性;(2)在整体水平能感受CO2刺激并引起适应性通气反应;(3)与呼吸节律中枢有功能上的联系,选择性地激活、抑制或者损毁此细胞群能易化或者抑制呼吸化学感受器反射。虽然NTS神经元基本上满足上述标准,但有些问题尚需进一步明确,例如NTS化学敏感性神经元是否有共同的分子标识?这些细胞上能感受CO2/H+的分子是什么?Paired-like homeobox 2b(Phox2b)是配对同源盒基因,编码一种同源盒转录因子,特异性地表达在呼吸反射传入通路的神经元上,例如,颈动脉体和主动脉体、岩状神经节、结状神经节、NTS和RTN等。而且,Phox2b基因突变是先天性中枢性低通气综合征(congenital central hypoventilation syndrome,CCHS)的重要致病因素,大多数CCHS患者的Phox2b(>90%)存在聚丙氨酸的重复扩张(杂合性突变),可能导致中枢化学感受器的结构性缺陷及功能紊乱。研究表明,几乎所有RTN的Phox2b神经元都具有化学敏感性,激活后参与呼吸调控,提示Phox2b可能是中枢化学感受器的一种重要的分子标识,但是NTS的Phox2b神经元是否具有化学敏感性及其离子机制尚待明确。本课题正是基于上述领域存在的科学问题而设计,具体内容如下:目的:本研究旨在应用电生理、单细胞RT-PCR和免疫组织化学技术,在Phox2b-EGFP-Jx101转基因小鼠的NTS区,观察(1)Phox2b神经元对CO2/H+的电生理反应;(2)CO2/H+敏感性神经元的生物化学表型的分析。方法:1 Phox2b-EGFP-Jx101转基因小鼠的鉴定:应用PCR技术进行基因型鉴定;免疫荧光技术测试绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的神经元是否为Phox2b免疫反应阳性。2在急性制备的小鼠脑片上,应用细胞贴附式和全细胞膜片钳技术,观察CO2/H+对Phox2b神经元自发放电频率、细胞膜电位和全细胞电流的影响。3应用单细胞RT-PCR技术对具有化学敏感性Phox2b神经元进行生物化学表型分析。结果:1免疫荧光结果表明,100%EGFP表达的NTS神经元为Phox2b免疫反应阳性。2在阻断突触传递条件下,Phox2b神经元的一个亚群(43%)表现为对CO2/H+的敏感性反应,这些神经元主要分布在NTS的中央亚核和背侧亚核。3细胞贴附式膜片钳记录表明,降低灌流液pH值或高碳酸溶液均使Phox2b神经元自发放电频率增加;因酸化使放电频率变化表现为持续性或瞬时性增加两种模式。4全细胞电流钳模式下,降低灌流液pH值使Phox2b神经元膜电位去极化,放电频率增加;全细胞电压钳模式记录到一种pH敏感性电流,反转电位大约是-85m V,推测为一种背景钾离子电流。5单细胞RT-PCR结果揭示,具有化学敏感性的Phox2b神经元均表达2型囊泡谷氨酸转运体(vesicle glutamate transporter 2,VGlut2),90%表达4型G蛋白耦联受体(G protein coupled receptor 4,GPR4)。结论:孤束核Phox2b神经元的一个亚群具有化学敏感性,这种特性是一种不依赖于突触传递的内在特性。这些神经元具有化学敏感性的分子基础可能是细胞膜上的GPR4和/或背景钾通道。