拟穴青蟹新的C型凝集素同源基因SpCTL6的免疫功能及其短肽抗菌活性的研究

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拟穴青蟹(Scyllaparamamosain),简称青蟹,是我国重要的海水养殖蟹类之一,具有丰富的营养价值和较高的经济价值。随着养殖规模的不断扩大,病原微生物感染所引发的病害问题,尤其是幼体发育过程中高死亡率和低蜕皮率等严重影响青蟹养殖业的健康发展。C型凝集素作为甲壳动物先天性免疫中重要的模式识别受体之一,广泛参与甲壳动物多种免疫相关过程,如凝集作用、调理作用、直接杀菌作用以及免疫调节作用等,在青蟹抵御病原体入侵中发挥重要功能。本论文通过分析前期实验室构建的青蟹幼体发育转录组数据库,筛选得到一条在青蟹蚤状幼体时期高表达的新的C型凝集素同源基因,命名为SpCTL6。以SpCTL6及其短肽Sp-LECin为研究对象,对SpCTL6和Sp-LECin的免疫相关功能进行研究,取得的具体成果如下:1.获得一条新的未报道的C型凝集素同源基因SpCTL6的全长cDNA序列。GenBank号为MW119266,全长为738bp,其中开放阅读框为486bp,共编码161个氨基酸。SpCTL6成熟肽具有C型凝集素保守结构域CRD(carbohydrate recognition domain)及糖类识别基序“QPT”(Gln-Pro-Thr)。三级结构预测结果表明SpCTL6成熟肽具有2个α-螺旋结构和5个β-折叠结构。2.分析了 SpCTL6基因在青蟹胚胎幼体不同发育阶段、仔蟹蜕皮前后及成熟雌雄蟹各组织中的表达特性。SpCTL6基因在青蟹整个蚤状幼体时期维持高表达;在仔蟹蜕皮后的表达量显著高于蜕皮前;在雄蟹精巢组织中的表达量最高,在雌蟹肌肉、卵巢、胃等其他组织中均有分布。3.研究了 SpCTL6基因在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后的青蟹幼体期和成熟雄蟹精巢中的诱导表达特性。LPS刺激后,SpCTL6基因在蚤状幼体Ⅰ期、大眼幼体时期及雄蟹精巢组织中均有显著性响应;溶藻弧菌感染后,SpCTL6基因在大眼幼体时期和雄蟹精巢组织中显著上调表达。4.获得SpCTL6重组蛋白(rSpCTL6)并研究其体外生物学功能。利用毕赤酵母真核表达系统成功表达并纯化获得高纯度的目的蛋白。研究发现rSpCTL6在体外具有结合多糖,凝集细菌和小鼠血细胞,促进青蟹血细胞包裹以及降低溶藻弧菌内毒素水平等作用,且对青蟹血细胞无细胞毒性。5.揭示rSpCTL6在青蟹体内的免疫保护作用。研究发现rSpCTL6能显著提高溶藻弧菌感染后青蟹的存活率,降低青蟹组织中的细菌载量,并显著增强免疫相关酶的活性以及上调若干免疫相关基因的表达水平。6.筛选获得具有抗菌活性的截短多肽Sp-LECin。研究发现SpCTL6蛋白中的106-127位多肽(命名为Sp-LECin)具有广谱的抗菌活性,且对多种动物细胞无细胞毒性,初步揭示其抗菌机制为破坏细菌细胞膜,造成内容物外泄,最终导致细菌死亡。
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